Genistein能影响HS成纤维细胞的生物学功能,包括抑制细胞胶原的合成、减少TGF-β1蛋白的分泌、降低细胞内Ca~(2+)离子浓度。 3. Genistein可通过抑制细胞受体型酪氨酸蛋白激酶信号转导途径而影响HS成纤维细胞的增殖与活化,其作用的主要信号通路可能为Ras→Raf→MEK→ERK/p38途径以及PI3K→Akt途径。
【研究背景】 肝细胞癌(HCC,以下简称肝癌)是最常见的恶性肿瘤之一。我国肝癌的主要病因为乙型肝炎病毒(HBV)感染,但其发生发展的分子机制尚未完全清楚。Notch信号是一个在进化中高度保守的反映细胞间通讯机制的通路,它调控细胞的分化和增殖,在胚胎发育和细胞命运的决定中发挥重要的作用。有研究表明Notch信号也参与肿瘤的发生发展,Notch受体和配体分子表达失调以及Notch信号的异常激活出现在一系列恶性肿瘤中。目前为止,Notch信号在肝癌中的作用及机制尚未见报道。

很少 【目的】 1. Notch受体和配体分子在人原发性肝癌中的表达;2. Notch信号与乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的关系;3. Notch信号对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及其机制。 【方法】 1.采用免疫组织化学方法检测Notch受体和配体分子在人原发性肝癌组织的表达,并分析上述分子的表达与肝癌患者临床病理学参数以及与HBx表达之间的关系;2.采用RT-PCR及Western Blot方法检测稳定转染野生型HBx基因的HepG2细胞(HepG2X)中Notch受体和配体分子的表达;3.分别用Ras及其下游信号分子MEK、PI3K以及p38的特异性抑制剂处理HepG2X细胞,Western Blot检测相关Notch分子的表达;4.采用共聚焦显微术以及免疫共沉淀技术检测Notch分子与HBx的表达共定位和蛋白分子相互结合关系;5.用双荧光素酶报告基因实验检测HBx对Notch信号的激活作用;6.采用正义基因转染、RNAi技术改变肝癌HepG2和SMMC7721细胞中Notch1的表达水平,建立稳定转染细胞系;7.用Notch信号的特异性抑制剂处理SMMC7721以及HepG2X细胞,得到整个Notch信号被抑制的细胞模型;8.利用MTT方法对上述转染子及抑制剂处理的细胞进行生长曲线的描绘,用平板克隆形成实验检测其单细胞克隆形成能力,软琼脂克隆形成实验检测锚定非依赖性生长的能力,裸鼠成瘤实验检测上述转染细胞在体内形成移植瘤的能力;9.采用PI染色流式细胞术检测上述转染细胞及抑制剂处理细胞的周期的变化,用Annexinⅴ/PI双染色流式细胞术、DAPI染色、透射电镜技术以及TUNEL染色检测其凋亡情况;10.用基因芯片技术筛选Notch信号相关的差异表达基因。

和 【结果】 1. Notch1、Notch2、Notch4及Jagged1在肝癌中表达失调 免疫组化结果显示Notch1、Notch2、Notch3、Notch4及其配体Jagged1、Delta4在人原发性肝癌组织的肿瘤细胞中存在强弱不等的表达,其中Notch1和Notch4表达于胞浆和胞核中,Notch1主要表达于胞浆,其阳性率为88.7% (47/53),少数几例表达于胞核,阳性率为9.4% (5/53);Notch4在胞浆和胞核中的表达情况相当,阳性率分别为67.9% (36/53)和58.5% (31/53),其余分子Notch2、Notch3及Jagged1、Delta4仅表达于胞浆,阳性率分别为26.4%(14/53)、52.8% (28/53)、79.2% (42/53)和67.9% (36/53)。与癌旁组织相比,胞浆Notch1、核Notch4以及Jagged1在肝癌组织中呈高表达,Notch2在肝癌中低表达,其余分子表达无明显变化。与临床病理学资料相关性的统计学分析显示Notch2、Notch3、Jagged1和Delta4的表达与患者年龄显著正相关,Notch1(胞浆)、Notch2、Notch3、Jagged1及Delta4的表达与肿瘤的分化程度显著相关;在HBV阳性的乙肝相关肝癌中Notch1(胞浆)、Notch4(胞核)及Jagged1的表达与HBx的表达呈显著正相关。 2.肝癌中Notch信号受HBx调节 在组织学研究的基础上,进一步检测了Notch受体和配体分子在体外培养肝癌细胞系中的表达,发现与组织中相一致的结果:上述Notch受体和配体分子的mRNA和蛋白在HepG2X和对照细胞中均有表达,在mRNA水平,HepG2X中Notch1和Jagged1的表达显著高于对照细胞;在蛋白水平HepG2X中Notch1的跨膜域(NTM1)、Notch4的胞内域(ICN4)及Jagged1的表达均显著高于对照细胞,其余分子表达与对照细胞无明显差异。用Ras或p38的特异性抑制剂处理HepG2X细胞可导致其Notch1的表达下调,而MEK和PI3K的抑制剂处理不能影响Notch1的表达,Ras的抑制剂不能影响Notch4及Jagged1的表达,显示HBx通过Ras-p38通路调节Notch1的表达。

这个 检测Notch1、Notch4和Jagged1与HBx的共定位和相互作用情况,结果发现在乙肝相关肝癌组织以及HepG2X细胞胞浆中Notch1和Jagged1与HBx分别存在表达共定位现象,在HepG2X细胞中Notch1和Jagged1分别与HBx存在蛋白分子相互结合关系。双荧光素酶报告基因实验显示HBx可以一种剂量依赖的方式直接激活肝癌HepG2细胞中Notch信号。 3. Notch信号通过加快细胞周期进展、抑制细胞凋亡从而促进肝癌细胞的恶性生长和增殖行为 对五株肝癌细胞系中Notch1表达水平的检测发现其在HepG2细胞中表达较低,在SMMC7721中水平较高。稳定转染Notch1胞内域(ICN1)的真核表达载体后,HepG2细胞的生长增殖能力、单细胞克隆形成能力、锚定非依赖性生长的能力以及裸鼠体内成瘤能力增强,细胞周期G1-S期的进展加快,细胞凋亡减少;而稳定转染Notch1-siRNA的SMMC7721细胞则出现上述生存能力下降,细胞周期G1-S期阻滞,细胞凋亡显著增加。用Notch信号的特异性抑制剂处理Notch信号活性较强的SMMC7721和HepG2X细胞后,同样发现细胞的生长增殖能力、单细胞克隆形成能力、锚定非依赖生长的能力较弱,细胞周期阻滞,细胞凋亡显著增多。基因芯片技术检测ICN1引起HepG2细胞中差异表达的分子,结果显示ICN1的异源性表达可引起HepG2细胞中一些影响细胞生长和迁移的分子表达失调。 【结论】 1. Notch信号分子在肝癌中的表达及意义:Notch1、Notch2、Notch4及Jagged1在肝癌与癌旁组织中差异表达,可能参与肝癌的发生发展;2. Notch信号与HBx的关系:HBx可调控Notch1、Notch4及Jagged1的表达和功能并激活Notch信号;3.