9×10~4CFU/mL；脂质体法所获得的病毒滴度为4×10~4CFU/mL。 使用单细胞培养法和组织块培养法培养MEFs，对丝裂霉素C处理MEFs制备饲养层细胞的浓度和处理时间进行摸索。结果表明，制备饲养层时最佳条件为10μg/mL的丝裂霉素C处理MEFs2h。 将逆转录病毒颗粒感染两次的hFFCs接种饲养层上，以培养iPSCs的方式培养，观察其变化。结果表明，含目的基因的逆转录病毒颗粒感染后的hFFCs与空白对照相比，细胞形态从典型的长梭形变成圆形、半椭圆、三角形或不规则形态，说明目的基因以逆转录病毒为载体导入hFFCs后，能引起hFFCs发生变化。
目的

点击此处 慢阻肺(COPD)患病率上升已成严重的公共卫生问题，该病主要机理为肺部慢性炎症，现无理想的治疗药物。羟基红花黄色素A（HSYA）为红花有效成分，预试发现它可抑制COPD大鼠炎症损伤及小鼠肺纤维化与TGF-β1表达上调、抑制TNF-α引发细胞炎症因子表达升高。本课题观察HSYA抑制COPD大鼠肺部炎症信号转导、细胞因子表达异常、炎症损伤及组织重构的药效，探索HSYA缓解烟熏-脂多糖诱发的大鼠慢性阻塞性肺病不同时间损伤的作用和HSYA缓解TGF-β1诱导NIH/3T3细胞的活化作用，探索HSYA缓解COPD慢性炎症和肺纤维化的机制，为开发抗COPD的新药提供依据。 方法 1.动物实验：以烟熏-脂多糖刺激wistar大鼠建立COPD模型。120只wistar大鼠按体重分层随机分为12组（N=10）：2周正常对照组、2周COPD组、2周COPD+35mg/kg HSYA低剂量组、2周COPD+70mg/kg HSYA高剂量组；3周正常对照组、3周COPD组、3周COPD+35mg/kg HSYA低剂量组、3周COPD+70mg/kgHSYA高剂量组；4周正常对照组、4周COPD组、4周COPD+35mg/kg HSYA低剂量组、4周COPD+70mg/kg HSYA高剂量组。病理切片HE染色在光学显微镜下观察各组大鼠肺组织结构； Masson染色光镜下观察各组大鼠肺组织及微小气管形态改变及胶原沉积情况；用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测各组大鼠肺泡灌洗液（BALF）中TNF-α、 IL-1β、 IL-6和TGF-β1的蛋白表达水平，用免疫组化的方法来检测各组大鼠肺组织中核因子p65和α-SMA的水平。 2.细胞实验：以TGF-β1诱导NIH/3T3细胞的活化为细胞模型，细胞分8组：正常对照组、 HSYA对照组、 TGF-β1组、 TGF-β1+0.5μmol/L HSYA组、TGF-β1+1μmol/L HSYA组、 TGF-β1+2μmol/L HSYA组、 TGF-β1+2μmol/LSB-431542组和TGF-β1+2μmol/L SB-431542+2μmol/L HSYA组。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞的增殖情况；细胞划痕实验观察各组细胞的迁移情况。 结果 1、动物实验： HE染色结果：显微镜下可见三个时间点的正常对照组大鼠的肺泡壁薄，肺泡腔清晰可见、结构完整，肺间质无炎症细胞浸润，细支气管无分泌物；与同一时间点的正常对照组相比，三个时间点COPD组肺组织HE染色光学显微镜下观察到均有炎性细胞浸润明显、细支气管渗出明显、肺泡壁增厚，三个时间点的COPD组相比较，2周COPD组的炎细胞浸润比3周COPD组和4周COPD组较明显，而肺泡壁增厚的情况随着烟熏时间的增加而逐渐加重，4周COPD组最为明显；与同一时间点的COPD组相比不同剂量的HSYA给药组的这些损伤均可见减轻，其中COPD+70mg/kg

EX 527数据表 HSYA高剂量组改善情况比COPD+35mg/kg HSYA低剂量组改善情况较明显。Masson染色结果：同一时间点的各组相比， COPD组与正常对照组比较， COPD组的Masson染色小气道周围胶原沉积明显增加，三个时间点的COPD组的小气道周围胶原沉积随着烟熏时间增加而逐渐增加；与同一时间点的COPD组相比，给予不同剂量的HSYA后炎症因子的高表达均受到抑制，其中COPD+70mg/kg HSYA高剂量组改善情况比COPD+35mg/kg 而且 HSYA低剂量组改善情况较明显。

ELISA法检测肺泡灌洗液结果：同一时间点的各组相比， COPD组与正常对照组比较， COPD组的肺泡灌洗液中炎症细胞因子IL-6、 IL-1β、 TNF-α和TGF-β1水平均明显升高(p均
目的:缺氧是许多临床常见疾病的共同病理生理过程,当机体尤其是心脏和大脑等重要器官遭受严重缺氧时甚至会导致死亡。氯化钴作为一个广为人知的缺氧模拟剂,它可以通过增加活性氧(Reactive oxygen species,ROS)产生、降低细胞活力、改变线粒体膜电位、激活Caspase-3和诱导凋亡产生缺氧/缺血性应答。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是一种具有多种生物学活性的细胞外分泌型信号多肽,可以通过调节细胞的增殖、分化、黏附、移行及凋亡,在生物体的发育过程中发挥重要作用。TGF-β1在心脏保护中的作用也一直是研究的热点,诸多报道表明其在心肌细胞损伤中通常扮演抗凋亡的角色。大鼠ZFP580是由本组克隆的一种C2H2型锌指蛋白,前期研究表明TGF-β1可诱导其表达,且ZFP580在缺氧/复氧损伤诱导的H9c2心肌细胞损伤中具有促进细胞存活及抗凋亡等细胞保护作用。然而,ZFP580在H9c2心肌细胞缺氧损伤中是否具有类似作用及具体机制,以及是否受到TGF-β1的调控仍不清楚。本实验拟通过氯化钴处理H9c2心肌细胞建立化学缺氧诱导的细胞损伤模型,探究ZFP580在TGF-β1抗H9c2心肌细胞缺氧损伤保护效应中的作用及具体机制。方法:MTT法检测细胞存活率;Real time-PCR测定ZFP580和HIF-1α的m RNA表达水平;Western-blot检测ZFP580、HIF-1α、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Bax、Bcl-2和Active Caspase-3的蛋白表达;Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡;DCFH-DA检测活性氧生成;使用SB431542阻滞剂及慢病毒干扰技术后检测相关指标。结果:1氯化钴处理降低细胞存活率并上调ZFP580和HIF-1α的表达氯化钴可呈时间和剂量依赖方式降低细胞存活率。给予H9c2心肌细胞不同剂量的氯化钴(400、600、800、1000μM)处理24 h,细胞存活率随着氯化钴浓度的升高而降低,结果显示600μM氯化钴处理24 h时细胞存活率接近50%。然后使用600μM氯化钴分别处理细胞0、4、8、12、16、20和24 h,发现细胞存活率与对照组相比在8、12、16、20和24 h显著降低(P<0.05);当转染过的细胞在暴露于氯化钴之前预先用TGF-β1处理,RNA干扰ZFP580抑制其表达会明显减弱TGF-β1的抗凋亡效果,凋亡细胞的比例显著增加(P<0.