76倍,说明C/EBPβ等均有可能是应答NGAL基因TPA反应性的核蛋白因子;进一步的特异性激酶抑制剂研究发现,MEK→ERK1/2细胞信号转导通路在TPA激活的NGAL基因转录中发挥主要作用。
背景与目的 CP 868596 p21 activated kinase1(PAK1)即p21小GTP酶活化激酶1,一类进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。PAK1是PAK家族中与人类肿瘤关系密切的成员,以二聚体形式存在,是小G蛋白Rho家族的下游靶蛋白,可被生长因子及其他胞外信号活化。多项研究提示PAK1主要还是通过影响MAPK及NF-κB等通路来发挥生物学效应。正常组织只在脑、肌肉和脾脏中检测到PAK1表达,其他组织表达很少；但在多种人类肿瘤中可见PAK1表达增高或过度活化。已有文献及我们的前期工作发现在正常肠粘膜向大肠癌的恶性演进过程中,在大肠腺瘤中就可以看到PAK1明显的高表达。这说明PAK1可能参与了大肠癌恶性演进发生的启动阶段,对大肠癌的发生发展起重要作用。而肿瘤细胞的过度生长是恶性演化启动阶段的典型事件。目前缺乏PAK1在大肠癌恶性增殖的关系及相关分子机制的研究。因此,本课题旨在研究PAK1在大肠癌增殖中的作用,并从体内和体外两方面探讨PAK1促进大肠癌细胞恶性增殖的机制。这对于明确大肠癌发生发展分子机制,为大肠癌的早期诊断和个体化治疗寻找新的分子标志都具有重要的意义。

材料和方法 1、主要材料 SW480、SW620、SW1116及LoVo大肠癌细胞株,真核细胞表达质粒pcDNA3.1-PAK1-T423E, pGPU6/GFP/Neo PAK1 shRNA, LipofectamineTM 2000, G418, PAK1、Cyclin D1、CDK4、CDK6、SAPK/JNK、phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185)等抗体,MEK1/2抑制剂U0126,p38 MAPK抑制剂SB203580,JNK抑制剂SP600125,10只SPF级BALB/c裸小鼠。 MLN2238购买 2、主要方法 2.1 PAK1 shRNA干扰载体的构建 从GenBank中选定人类PAK1编码基因PAK1

mRNA序列(NM_001128620),依照shRNA的设计原则,设计4条shRNA片段,并设计一对非相关核苷酸序列作为阴性对照,利用BLAST在EST数据库查询,均未发现与另外任何基因同源,pGPU6/GFP/Neo shRNA表达载体的制备交由上海吉玛制药有限公司完成。 2.1.2 CCK-8法检测细胞增殖 接种处理好的单细胞悬液于96孔板,每孔100μl RPMI-1640完全培养基含2000(增殖实验)或3000(增殖抑制实验)个细胞,每组设6个复孔,不同处理时间后,加入CCK-8溶液10μl,继续培养2h后在450nm波长下,酶联免疫分析仪测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横轴,光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线,实验重复两次,数据以mean±SD表示。2.2流式细胞术检测细胞周期 AUY-922 价格 将经过血清饥饿同步化之后或者SP600125处理的细胞用0.25%胰酶将细胞从培养瓶底消化下来,1200转离心5min。用lxBuffer A洗涤细胞一次(2000转,5min),收集并调整细胞浓度为1×106/mL。细胞加9倍体积预冷的70%乙醇,于20℃固定24小时。离心收集细胞后,用1xBuffer A洗细胞以除去乙醇,细胞重悬于500μl BufferA中。加入12.5μl RNaseA(终浓度为0.25mg/ml),37℃反应30min。加入5μl PI室温避光染色30min。流式细胞仪激发波长488nm处检测细胞周期含量。 2.3流式检测细胞凋亡 用0.25%胰酶将LoVo细胞的干扰组及对照组细胞从培养瓶底消化下来,1200转离心5min,细胞计数；各组细胞以1×105细胞/孔接种于6孔板,每组设3个复孔；接种后24h细胞密度为80%时,更换培养基,各孔加入0.2%FBS的低血清培养基饥饿48h诱导细胞凋亡；血清饥饿法诱导细胞凋亡48小时后,用0.25%胰酶(不含EDTA)将六孔板上的细胞消化下来(消化时间不易过长,否则容易引起假阳性)；用PBS洗涤细胞二次(2000转离心5min),收集1-5×105细胞；吸取500ul

1X Binding Buffer加入到细胞悬液里；然后加入5μl的Annexin V-PE和10μl的7-AAD；室温、避光、反应5-15min；流式细胞仪检测细胞凋亡率。2.4软琼脂克隆形成实验 用RPMI 1640配制5%琼脂糖(Gibco)高压消毒备用,用前加热到到凝胶完全融化并50℃保温,加37℃预热的含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液到工作浓度；底层琼脂糖凝胶中琼脂糖终浓度为0.5%,每直径3.5cm的培养皿加1ml上层凝胶琼脂糖终浓度为0.33%,余同底层胶,直径3.5cm的培养皿加1 ml；细胞悬液制备：取对数生长期的各组细胞,0.25%胰酶消化,镜下计数,加入到上层凝胶到浓度为500/ml,每孔约500个细胞每种细胞设三个平行对照,以转染空载体的LoVo为阴性对照；凝胶在室温完全凝固后,培养皿加含双抗的10%FCSRPMI-1640 2ml,37℃5%CO2培养。每3-4天拿出培养皿冷却到室温,更换培养基,至21天终止。结果判定：大于50个细胞的克隆为有效克隆,计算有效细胞克隆数并分析结果。2.