23%。 1 2细胞凋亡结果显示CML CD34+干/祖细胞对IM不敏感;经过IM处理后miR-21表达水平有一定的上调;转染an

23%。 1.2细胞凋亡结果显示CML CD34+干/祖细胞对IM不敏感;经过IM处理后miR-21表达水平有一定的上调;转染antagomiR-21能显著增加IM诱导的CML CD34+干/祖细胞凋亡,细胞凋亡率由对照组的3.983±0.2973增加至9.437±0.5601。

1.3Sup-15细胞对IM诱导的细胞凋亡不敏感;在IM处理后miR-21表达也发生一定的上调;转染antagomiR-21明显地增强IM诱导Sup-b15细胞凋亡。 1.4IM对K562和Ku812细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用随着IM浓度的升高以及处理时间的延长显著升高;在IM处理后K562和Ku812细胞的miR-21表达均下调;转染agomiR-21能抑制IM诱导K562和Ku812细胞凋亡。 2.探讨miR-21调控CML CD34+干/祖细胞对IM凋亡抗性的分子机制研究 2.1IM处理后CML CD34+干/祖细胞和Sup-b15细胞的PDCD4表达水平下调,K562和Ku812的PDCD4表达水平上调;而CML CD34+干/祖细胞和三种Ph+白血病细胞(K562、Ku812、Sup-b15)的PTEN表达水平均下调;转染antagomiR-21后CML CD34+干/祖细胞PDCD4、PTEN和p-AKT的表达水平均下调。 2.2使用PI3K抑制(Wortmannin和LY294002)阻断PI3K/AKT信号通路后,IM诱导的CML CD34+干/祖细胞和Sup-b15的细胞凋亡显著增加。 2.3使用PI3K抑制剂(Wortmannin和LY294002)阻断PI3K/AKT信号通路后,IM诱导的CML CD34+干/祖细胞和Sup-b15细胞的p-AKT蛋白表达均显著下调。 结论 miR-21通过PI3K/AKT信号通路介导CD34+干/祖细胞和Sup-b15细胞对IM的凋亡抗性。
HER3与HER2同属EGFR (epidermal growth factor selleck receptor)家族的重要成员,同为跨膜酪氨酸激酶受体(RTK),其与多种人类癌症的形成、进展有关。研究发现HER3蛋白与HER2蛋白的表达高度相关,HER3是辅助HER2形成异源二聚体及致癌作用的重要因子之一。在乳腺癌患者中,HER2、HER3阳性率分别达到50%、41.8%。当乳腺癌患者HER3、HER2同为阳性时,其对HER2靶向药物曲妥珠单抗(Herceptin)的反应效果不佳。因而,通过抑制或阻断体内HER3水平,可能是治疗乳腺癌等癌症的一种重要途径。 【目的】 此网站 本研究采用人源化抗体库构建及筛选新思路,即将免疫后的鼠源VH-CDR3库(librare of CDR3of variable region of the murine heavy chain)移植到修饰后的人源scFv(single-chain antibody fragment)框架上,构建抗HER3人源化单链抗体基因库,并对该人源化抗体基因库进行筛选,以期获得具有潜在应用价值的抗HER3人源化单链抗体。另一方面拟通过本论文的实施,建立一种新的人源化抗体筛选技术,为快速获得人源化抗体提供一个新参考。

【方法】 1.人源化抗体基因库构建:采用HER3抗原免疫Balb/c小鼠,当抗血清效价达到1:200000时,从被免疫的小鼠脾细胞中提取总RNA,经反转录PCR(RT-PCR)获得总cDNA。以总cDNA作为模板,采用兼并引物进行PCR扩增,从而获得鼠抗体重链可变区基因库(VH),然后再以VH为模板,扩增出鼠VH-CDR3基因库。将鼠VH-CDR3库通过PCR扩增技术移植到经过修饰的人源单链抗体VH3-VΚ1上,实现抗HER3人源化抗体基因库的构建。 2.核糖体展示技术富集筛选:针对HER3抗原,经三轮兔网红细胞核糖体展示富集抗HER3的单链抗体基因。为便于后续基因库的高效克隆和表达,对回收的人源化抗体库进行基因结构单元的改进,即在基因库的N-端添加T7启动子、SD序列、PelB等表达原件,C-末端添加携带2个(His)6标签的序列,构建可直接用于TA克隆和表达目标蛋白的人源化抗HER3单链抗体基因库。

3.人源化抗体筛选与鉴定:展示后回收的HER3单链抗体基因库通过TA克隆,转化至大肠杆菌BL21(DE3),用菌落PCR鉴定克隆。分别用HER3抗原和抗VH3-VΚ1兔多克隆抗体等对筛到的阳性克隆的可溶性表达产物进行ELISA筛选,随之对亲和力较高的菌株表达产物进行纯化并测定其亲和常数。 【结果】 本研究成功构建了一个库容达1012的人源化抗HER3单链抗体基因库,经过三轮核糖体展示对抗HER3抗体基因库进行了富集,通过改良的TA克隆技术对目标基因库进行了克隆、表达以及产物鉴定。通过对亲和力较高菌株的表达产物进行纯化并测定其亲和常数,成功获得亲和力达3.02110-8M的人源化抗HER3单链抗体。 还有 【结论】 本研究为开发抗HER3抗体新药研究提供了有价值的先导抗体分子。此外,通过本课题的执行,建立了一种快速筛选人源化单链抗体的新技术途径,从而为其它人源化抗体的筛选提供一个有价值的参考。
目的:探讨Pim-1及C-myc在多发性骨髓瘤发病机制中的可能作用。莫罗尼鼠白血病病毒前病毒整合基因(Proviral integration of moloney murineleukemia virus,Pim)是一种原癌基因,它编码的蛋白是丝/苏氨酸激酶中的一种,主要涉及细胞周期的调节、蛋白质的转录与翻译、促凋亡、细胞代谢的调节及介导耐药蛋白的产生,与肿瘤的发生密切相关。Pim家族由Pim-1、Pim-2、Pim-3成员组成,可根据选择不同的转录位点编码不同的蛋白,均属于钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶家族。但它们在不同组织中得表达情况却不一样:Pim-1高表达于造血细胞,Pim-2高表达于脑和淋巴细胞,而Pim-3则高表达于肾脏、乳房和脑细。已有文献显示[29]骨髓瘤细胞系中不同程度的表达Pim-1、Pim-2及Pim-3。C-myc是一种多功能的原癌基因,位于人类染色体8q24上,其不仅具备转录因子的功能促进细胞增殖,还可以抑制细胞的分化、促进细胞周期的进展并抑制细胞的凋亡。C-myc基因能够通过扩增和染色体易位重排而激活,在肿瘤的发生发展中具有重要作用,已发现在多种人类肿瘤包括乳腺癌、急性白血病、骨肉瘤中的表达上调,而在小鼠浆细胞瘤和人类多发性骨髓瘤患者中也均发现C-myc的重排和过度表达。本课题采用RT-PCR和Western Blot两种方法检测Pim-1及C-myc在多发性骨髓瘤患者及正常对照组中的表达情况并探讨Pim-1及C-myc在多发性骨髓瘤发病机制中的可能作用,为多发性骨髓瘤的诊疗提供新的思路及方法并寻找相关的理论依据。 方法:1.选取2012.07-2013.09来本院就诊的22例初诊MM患者骨髓液作为初治组,选取2013.01-2013.09初诊的10例排除恶性血液病患者(排除肿瘤、感染、免疫系统疾病等影响试验结果疾病)骨髓液作为正常对照组。2.

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