2%MPTP溶液,剂量为20mg/(kg·d),连续注射5d,建立PD模型,并进行相应治疗。动物存活期为28d。 主要实验结果如下： 1.针刺舞蹈震颤控制区对PD模型小鼠行为学的影响 腹腔注射MPTP后,小鼠出现不同程度的肢体震颤,竖毛竖尾急性反应。造模5天后小鼠出现体重减轻、毛色暗淡、行动迟缓等表现,爬杆时间延长。对爬杆时间进行评分,与正常组相比,模型组计分比正常组明显减少(P<0.05),三个治疗组较模型组均有明显增加(P<0.05),但针刺组和针美组的数量较模型组和美多巴组增加,其中针美组的数量较美多巴组显著增加(P<0.05)；而针美组表达比模型组明显增加(P<0.05)；针刺组、针美组表达比模型组明显升高(P<0.05)；针刺组表达比美多巴组表达明显升高(P<0.05)；针美组表达比针刺组明显降低(P<0.05),针刺组CA1-CA4区比正常组、模型组和美多巴组的表达有明显升高(P<0.05)；针美组的CA1和CA2区的表达较模型组明显升高(P<0.05),其中美多巴组的表达最低,但针刺组的表达与正常组无明显差别；针刺组及针美组与美多巴组比较,表达量明显上升(P<0.05)；针美组在CA1、CA3和CA4区的表达比模型组和美多巴组明显升高(P<0.05)；针美组在CA1和CA4的表达比针刺组有明显上升(P
目的：癫痫是神经系统中一种常见的综合征，可发生于各个年龄阶段的人群，流行病学调查显示：全世界大约有5000万癫痫患者，我国的癫痫患病率为3.5‰-4.8‰。癫痫具有反复发作的特点，其病理生理基础是脑部神经元高度同步化异常放电导致正常的生理功能紊乱。短暂的反复发作或者一次持续发作均可导致严重的神经元凋亡,尤其是海马等边缘系统的神经元凋亡更为明显。研究表明，神经元凋亡和神经胶质细胞增多能够促使海马硬化，海马硬化导致癫痫频繁发作甚至形成难治性癫痫。因此，深入研究癫痫发作后神经元凋亡的分子机制，探索新型有效的抗神经元凋亡的药物具有深远的意义。

CAL-101核磁共振 本实验以杏仁核电点燃的慢性癫痫大鼠模型作为研究对象，以α-硫辛酸（α-lipoic acid,α-LA）作为干预剂。分别检测大鼠点燃前后的后发放阈值（ADT)，达到每个发作等级所需的累积刺激数及累积后发放持续时间(ADD)，应用Western Blot方法检测p38MAPK及p-p38MAPK在海马组织中的表达情况，应用流式细胞分析碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色技术检测海马神经元凋亡率。从而研究α-LA对杏仁核电点燃癫痫大鼠的行为及海马p38MAPK表达的影响，并初步探讨α-LA对杏仁核电点燃致痫大鼠的脑保护作用及分子机制。 那个 方法：选用雄性健康清洁的Wistar大鼠36只，体重在250-300g之间。随机分为正常对照组:不予以任何处理；α-LA组：每天给予α-LA（40mg/kg）腹腔注射一次；假手术组：杏仁核植入电极后不予以任何处理；电刺激模型组：植入电极后每天给予120%的点燃前ADT刺激一次；电刺激+α-LA低剂量组：植入电极后每天给予α-LA （20mg/kg）腹腔注射30min后以120%的点燃前ADT刺激一次；电刺激+α-LA高剂量组：植入电极后每天给予α-LA AZD4547 （40mg/kg）腹腔注射30min后以120%的点燃前ADT刺激一次，连续刺激15天，每组6只大鼠。依据Racine六级评价标准观察大鼠的行为学表现，记录大鼠每天的发作等级及ADD。造模结束后对大鼠采用断头取脑并快速分离海马组织，用Western

Blot方法检测p38MAPK及p-p38MAPK的表达水平，并用流式细胞术PI染色技术检测海马神经元凋亡率。 结果： 1.行为学观察①达到第一次Ⅴ级发作所需的累积电刺激数：与模型组（10.17±0.31）相比，电刺激+α-LA高剂量组（11.50±0.43）明显增多（P0.05)。②达到第一次Ⅴ级发作所需的累积ADD：与模型组（235.83±5.00）相比，电刺激+α-LA低剂量组（191.17±5.82）和电刺激+α-LA高剂量组（184.83±7.60）明显缩短（P0.05）。③点燃前后的ADT：模型组点燃后的ADT（133.33±12.29）较点燃前（273.33±24.59）明显降低（P<0.05）；电刺激+α-LA高剂量组点燃后的ADT（200.00±17.13）较点燃前（286.67±22.31）明显降低（P<0.05）；电刺激+α-LA低剂量组点燃后ADT（153.33±19.78）较点燃前（280.00±30.55）明显降低（P<0.05）。④点燃后ADT：与模型组相比，电刺激+α-LA高剂量组明显增高（P0.05）。假手术组、正常对照组、α-LA组大鼠均无癫痫发作。 2.Western Blot检测结果假手术组、正常对照组、α-LA组的海马组织内p-p38MAPK表达水平分别为0.55±0.06、0.62±0.05、0.64±0.05，差异无统计学意义（P>0.05）。与电刺激+α-LA低剂量组(2.20±0.04)和电刺激+α-LA高剂量组(1.26±0.93)相比，模型组海马p-p38MAPK表达水平(3.39±0.

05。Rapamycin组中,神经元中和胶质细胞的自噬的表达在4h、1d、3d、7d和21d逐渐升高,较单纯的脊髓损伤组有所提高,且差异具有统计学意义,P<0.05。Rapamycin组中,Bcl-2的表达在脊髓损伤4h、1d、3d、7d和21d后较单纯的脊髓损伤组有所升高,且差异具有统计学意义,P<0.05。经过Western检测,我们发现单纯的脊髓损伤组各个时间点的BAX的表达较正常对照组均有所下降。3-MA组中,BAX的表达在脊髓损伤4h、1d、3d、7d和21d后较单纯的脊髓损伤组有所上升,且差异具有统计学意义,P<0.05。Rapamycin组中,BAX的表达在脊髓损伤4h、1d、3d、7d和21d后较单纯的脊髓损伤组有所下降,且差异具有统计学意义,P<0.05。结论脊髓损伤后,自噬的抑制能够诱发神经元和胶质细胞的凋亡,自噬的增强能够抑制神经元和胶质细胞的凋亡；自噬的抑制能够抑制Bcl-2的表达,促进BAX的表达,自噬的增强能够促进Bcl-2的表达,抑制BAX的表达。
成人原发性中枢神经系统肿瘤中，包括多种组织学类型的脑神经胶质瘤是最为多见的。而恶性级别最高的要数胶质母细胞瘤，GBM的标准治疗包括早期肿瘤的手术切除、口服烷化剂替莫唑胺（TMZ）化疗及辅助性放疗结合。不过，由于这些肿瘤令人难以置信的耐药和肿瘤频繁复发，胶质母细胞瘤对外科手术治疗、放化疗极其耐受，GBM的中位生存时间仅限于诊断后约15个月。除了肿瘤细胞自身对放疗、化疗的抵制，肿瘤与内环境之间的相互作用还通过参与肿瘤的抗血管生成、组织缺氧和免疫抑制。化疗药物在恶性胶质瘤的治疗中发挥重要作用。新一代烷化剂替莫唑胺是目前对恶性胶质瘤的标准化疗药物，并已被证明有着良好的临床治疗效果。替莫唑胺是经过O6-G甲基化诱导的引发DNA损伤激活的错配修复机制，然而，由于化疗药物内在性和获得性耐药现象还有血脑屏障的存在，很大程度上影响了化疗效果。

点击此处 AKT作为PI3K/AKT传导途径中的关键因子，在促成肿瘤细胞生长增殖、血管的生成、增加侵袭转移的发生、抑制肿瘤的凋亡和抵制放化疗中起着非常关键的作用。大量文献报导AKT在肿瘤的发生发展及转移中扮演了重要角色，更深入的研究AKT作用的分子生物学机理并发现其与恶性癌症的相关性，有可能为癌症的基因治疗、抗肿瘤药物的开发研究提供新的思路和作用靶点。我科前期实验通过GBM基因芯片研究发现了29条基因和替莫唑胺化疗耐药相关且影响患者生存期，AKT2基因就是其中一个。近年来，一些实验研究已经表明PI3K/AKT信号传导途径与癌症化疗疗效关系比较密切。AKT活化还可能参与肿瘤放射治疗的抵抗，研究结果表明AKT2似乎是一个有效的克服胶质瘤治疗抵抗重要靶标。根据既往实验结果我们初步推测沉默AKT2基因表达可能成为临床上增加胶质瘤化疗敏感性的一种可行性的方法。本实验将分四部分研究AKT2基因沉默在胶质母细胞瘤中对替莫唑胺化疗疗效的改变及其作用机理。第一部分，RNA沉默AKT2的表达对胶质瘤U251细胞株替莫唑胺疗效的影响；第二部分，RNA沉默AKT2的表达对胶质瘤裸鼠移植瘤的替莫唑胺疗效的影响；第三部分，胶质瘤替莫唑胺化疗耐药细胞株的建立及其特性鉴定；第四部分，AKT2在胶质瘤细胞中替莫唑胺化疗抵制的作用机理研究。通过以上实验阐明AKT2基因在脑胶质瘤莫唑胺化疗耐药中的分子生物学机制，在分子水平上寻找和莫唑胺化疗耐药相关的关键基因及其作用机制，提高临床上脑胶质瘤患者对替莫唑胺的化疗敏感性。 Cell Cycle抑制剂 第一部分RNA干扰AKT2的表达对胶质瘤U251细胞株替莫唑胺敏感性的影响目的：研究胶质母细胞瘤U251细胞中AKT2基因沉默对替莫唑胺化疗效果的改变。方法：AKT2基因慢病毒载体的构建，然后在体外条件下将AKT2特异性shRNA表达载体AKT2-shRNA转染至U251细胞株中。蛋白印迹、Real-time

PCR实验方法测定转染shRNA后U251细胞中AKT2基因表达水平的变化，应用CCK8法检测RNA干扰AKT2后U251细胞对替莫唑胺敏感性的变化情况。 结果：转染AKT2-shRNA后U251细胞AKT2基因表达程度较U251未转染组和U251转染阴性慢病毒组都显著下降；替莫唑胺对U251细胞的半数细胞抑制浓度（IC50）从U251空白对照组的(39.72±2.41)μg/ml、阴性对照组的(39.43±2.24)μg/ml降到(27.23±1.93)μg/ml，AKT2干扰组U251细胞对TMZ药物的疗效变化有显著性差异（P＜0.05）。 INK1197化学结构 结论：AKT2-shRNA能够抑制胶质母细胞瘤细胞株U251中AKT2表达，并能增加对替莫唑胺的敏感性。 第二部分RNA干扰AKT2表达对胶质瘤裸鼠移植瘤替莫唑胺敏感性的影响 目的：研究RNA沉默AKT2对脑胶质瘤移植瘤的替莫唑胺疗效的改变。 方法：首先，构建胶质瘤裸鼠成瘤模型，瘤内注射和腹腔内给TMZ药物，以替莫唑胺化疗药物和AKT2-shRNA表达载体对成瘤后的裸鼠瘤体进行联合干预治疗，进而观察并测量各组裸鼠肿瘤体积大小。Real-time PCR及免疫组化实验分别测定各组裸鼠肿瘤细胞的AKT2的表达程度， TUNEL实验测定并计算分析各组裸鼠成瘤后肿瘤组织细胞的凋亡的变化。 结果：空白对照组、替莫唑胺化疗组、TMZ+阴性对照组、TMZ+AKT2干扰组裸鼠瘤体体积分别为：(669.34±98.73) mm3、(399.86±55.26) mm3、(383.81±34.01) mm3、(297.72±41.49) mm3；瘤体质量分别为：(1.25±0.26)g、(0.72±0.11)g、(0.69±0.07)g、(0.52±0.07)g。TMZ+AKT2干扰组其肿瘤体积及瘤体质量都明显小于空白对照组、替莫唑胺组和TMZ+阴性对照组，有显著性差异（P＜0.05）。免疫组化和Real-time PCR实验表明TMZ+AKT2干扰组比其他对照组AKT2表达程度显著降低（P＜0.

25±0.08 pmol/mg；与IR组比较,MC组明显降低移植心AI[3h:(8.65±2.01)％vs.(19.28±4.94)％,P<0.01；24h:(5.82±2.36)％vs.(10.54±3.66)％,P<0.05].激活Akt蛋白(3h:P<0.01；24h:P0.05)。 结论诱导受体产生CO能明显抑制冷缺血再灌注诱导的移植心的细胞凋亡,其机理可能与通过P13K/Akt信号途径对凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax的调节有关。 第四部分 诱导受体产生一氧化碳减轻同种移植心排斥反应不依赖于Foxp3表达的上调 目的CO由于具有强大的干扰体内氧运输的特性而通常被认为是一种有害的废弃物。事实上,低浓度的CO通过调节血管张力、抗炎、抗凋亡等作用缓解移植物缺血再灌注损伤。本研究在小鼠心脏移植的基础上,观察诱导受体小鼠产生CO对同种移植排斥反应和移植心存活时间的影响,并探讨其可能的机制。 方法建立小鼠颈部异位心脏移植模型(C57BL/6→Balb/c小鼠)。受体小鼠自移植前1d至移植后第6d(MC1w组,n=11)或至第13d(MC2w组,n=10)以含二氯甲烷(MC)100mg/kg体重灌胃,或以同体积不含MC的橄榄油灌胃(Tx组,n=6)。观测移植心存活时间,并于移植后6d、10d分别检测受体血清TNF-α、IL-10的含量、心脏移植物和受体脾脏TNF-α、IL-10、Foxp3 mRNA及Foxp3蛋白的表达、心脏移植物ICAM-1(细胞间粘附分子-1)及Caspase-3蛋白的表达；观察移植后6d、10d或移植物心跳停止时移植心胶原纤维增生程度及组织病理学变化。

结果受体以MC灌胃后血液中COHb浓度在3h达到峰值,为(5.24±0.45)%；受体诱导CO可以明显延长移植心存活时间[Tx:(6.33±0.56)d; MC1w: (12.14±0.87)d, P<0.01vs.Tx)及Caspase-3的表达(MC1w组：P0.05)。 结论受体小鼠诱导CO明显减轻同种移植排斥反应并延长移植心的存活时间,其主要机制与可能与CO的抗炎症和抗凋亡功能密切相关,而并不依赖于移植物和受体脾脏内Foxp3表达的上调。
活化淋巴细胞来源DNA 购买Cyclopamine (ALD-DNA)诱导系统性红斑狼疮(SLE)的新机制：巨噬细胞极化及其作用 还有 系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一个潜在的致死性疾病,以出现各种典型的自身免疫症状包括自身免疫反应、血管炎、关节炎和肾小球肾炎等为特征。在美国SLE病人总数已经超过二十五万,90%发生于育龄期妇女,严重影响人类健康。随着治疗手段的进步,狼疮性肾炎病人5年的生存率从二十世纪五十年代的44%提高到现在的82%,但是SLE病人的平均寿命只有44岁。SLE以其复杂多变的症状引起临床工作者的广泛关注,而SLE几乎累及免疫系统的各个成份,更是引起了免疫学工作者极大的兴趣,针对SLE的发病机制和SLE防治方法的研究一直是科学家关注的重大前沿课题。

作为SLE病人血清学特征的抗双链DNA (double-stranded DNA, dsDNA)抗体,已经被证明是致病性的,可以引起免疫复合物沉积和组织损伤,与SLE疾病的严重程度密切相关。SLE病人遗传学的研究发现抗dsDNA自身抗体大多属于对dsDNA具有高亲和力的IgG亚类,不同于体细胞突变产生的抗体。研究显示自身DNA可以诱导抗dsDNA抗体产生。一般情况下,哺乳动物的DNA免疫原性较弱,不会引起免疫应答。寻找引起自身免疫反应和抗dsDNA抗体产生的驱动成份是免疫学家关注的热点。我们实验室在寻找SLE驱动原的过程中发现用活化淋巴细胞来源的DNA (activated lymphocyte-derived DNA, ALD-DNA)免疫同系的雌性BALB/c小鼠,可以产生一系列的SLE症状,包括高水平的抗dsDNA自身抗体、蛋白尿、免疫复合物沉积和肾小球肾炎,这些症状模拟病人体内由大量凋亡细胞来源的自身DNA引起的SLE症状,因此ALD-DNA免疫的小鼠可以被作为理想的小鼠狼疮模型进行探讨SLE疾病可能的细胞与分子免疫学机制。 selleck kinase抑制剂 SLE通常被认为是由自身抗体介导的全身性炎症反应和由T／B细胞介导的适应性免疫应答所诱发的组织损伤,但是SLE发病和疾病进展的细胞与分子机制仍不清楚。有研究提示,在SLE小鼠中,显著激活的巨噬细胞和其它髓系细胞大量浸润到淋巴组织和肾脏中,启动和促进适应性免疫应答,从而导致SLE的发生。越来越多的证据显示F4／80+巨噬细胞是SLE肾炎中主要的浸润细胞,在SLE肾炎的发生过程中扮演重要角色,而浸润的巨噬细胞发挥保护性还是病理性作用有待阐明。功能上的可塑性和多样性是单核巨噬细胞的显著特点之一,巨噬细胞随着周围环境的变化,功能上会发生显著变化,这些功能上的变化,也称为功能上的巨噬细胞极化,可以产生有不同基因表达谱和不同功能的巨噬细胞亚群。目前认为M1和M2(包括M2a、M2b和M2c)是单核巨噬细胞功能上连续变化过程的两个极端。在SLE疾病过程中巨噬细胞是否发生极化、极化类型及其机制鲜有报道。 本研究的目的在于：(1)探讨巨噬细胞在ALD-DNA诱导SLE发病中的作用；(2)通过表型分析和细胞因子表达谱鉴定,分析SLE模型鼠肾炎组织中巨噬细胞的活化和极化类型以及可能的分子机制；(3)研究导致自身DNA清除障碍和打破免疫耐受引起巨噬细胞产生免疫应答的机制；(4)设计体内外实验探索SLE疾病可能的防治方法。我们的研究分为以下四部分：

1.巨噬细胞在ALD-DNA诱导SLE发病中的作用 体内未被清除的凋亡细胞来源的自身DNA具有免疫原性,可以引发一系列的免疫应答,从而导致抗自身DNA的抗体产生和抗体介导的组织损伤,这在SLE病人体内非常普遍,但是巨噬细胞是否在SLE发病过程中发挥作用仍不清楚。在本课题中,我们在ALD-DNA免疫的SLE小鼠模型中,发现狼疮肾炎组织中有大量的活化巨噬细胞浸润。ALD-DNA可以在体内和体外诱导巨噬细胞分泌细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10,并上调表达表面活化标志包括MHC class-Ⅱ、CD40、CD80和CD86,但是非活化淋巴细胞来源的DNA (unactivated lymphocyte-derived DNA, UnALD-DNA)并不能引起巨噬细胞的活化。我们进一步发现活化的巨噬细胞在体外可以促进T分泌IL-4和IL-10,促进B细胞产生抗dsDNA的自身抗体,从而参与ALD-DNA诱导的自身免疫反应。更重要的是去除SLE模型小鼠体内的巨噬细胞可以有效减轻尿蛋白水平、缓解狼疮性肾炎的症状。这些研究结果提示巨噬细胞在SLE发病过程中扮演重要角色,ALD-DNA通过诱导巨噬细胞活化进而启动针对自身抗原的固有免疫和适应性免疫应答,从而造成免疫复合物沉积和组织损伤。以上发现为SLE的发病机制提供了新视野,为临床SLE疾病的治疗提供了以控制巨噬细胞浸润和活化作为靶点的可能的新治疗策略。 2.