人根尖牙乳头感干细胞的分离、培养及鉴定 选取因正畸原因而拔除的年轻患者第三磨牙，分离培养人原代SCAPs,有限稀释法纯化获得单克隆的细胞；免疫组织化学染色及流式细胞仪鉴定间充质干细胞标记物STRO-1等；成骨诱导、成脂诱导实验证实细胞的多向分化能力。 Pifithrin-α数据表 2.转录因子NFIC促进SCAPs分化能力 构建NFIC慢病毒真核表达载体plenti-NFIC后，与沉默NFIC的siRNA分别转染SCAPs。过表达NFIC还促进SCAPs的增殖能力、ALP活性和成骨/牙分化能力。此外，NFIC还不同程度地增强矿化基因标记物ALP、OCN和Col.I的mRNA；蛋白质印迹免疫检测技术也证实NFIC上调DSP蛋白水平。而沉默NFIC,则明显抑制SCAPs矿化能力及矿化基因ALP、OCN和Col.I的表达。此外，过表达NFIC增强脂滴的形成和成脂标记物CCAAT增强结合蛋白（CCAAT/enhancer

binding protein）C/EBP-β、C/EBP-δ和过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor-y，PPAR-γ）的表达。 体内研究进一步证实：过表达NFIC的SCAPs细胞复合胶原/煅烧牛骨(calcinedbovine bone，CBB)材料植入免疫缺陷型小鼠的皮下12周后，可促进形成类成牙本质细胞和牙本质样结构。 3.转录因子NFIC参与TGF-β1信号通路对SCAPs的调控 不同浓度TGF-β1均抑制SCAPs增殖和体外矿化结节形成，并下调矿化基因的表达，而分别应用TGF-β1Ⅰ型受体抑制剂SB431542和Smad3的抑制剂SIS3阻断TGF-β信号通路后，可部分逆转TGF-β1对SCAPs增殖和分化的抑制作用。TGF-β1抑制NFIC蛋白的表达，过表达NFIC减弱TGF-β1对SCAPs矿化能力的抑制作用，而沉默NFIC则增强了TGF-β1对SCAPs成牙/骨的分化能力。实验结果显示NFIC参与TGF-β1信号通路对SCAPs的生物学调控。 综上所述，本研究通过体内/外实验证实NFIC可以促进根尖牙乳头干细胞的增殖和分化能力；而TGF-β1则起抑制作用；且NFIC参与了TGF-β1对根尖牙乳头干细胞分化特性的调控。本实验结果为阐述NFIC在调控SCAPs定向分化中的重要作用；同时为进一步研究SCAPs在牙髓牙本质再生和生物学牙根的组织工程研究提供了新的研究思路。
诱导性多能干细胞(Induced

有 Pluripotent Stem Cell,iPSC)是近年来干细胞研究领域中具有里程碑意义的突破。由体细胞重编程而来的hiPSC为获得与患者自身遗传背景一致的多能干细胞增加了一个新途径,是再生医学和组织工程、疾病模型、药物筛选的理想种子细胞,具有广阔的临床应用前景。而hiPSC体外培养条件是否合适则是决定其是否具有应用前景的前提,因此也是研究者关注的热点。 hiPSC的培养包括了体细胞重编程为hiPSC的过程(称为hiPSC的诱导培养)和hiPSC的扩增培养两个过程。“合适”或者“理想”的hiPSC的培养条件不仅要在扩增培养时维持hiPSC的生物学特性、符合临床应用前景,还包括这种培养条件是否可同时支持体细胞重编程。目前主要使用小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse

MDV3100体外 Embryonic Fibroblast,MEF)作为滋养层支持hiPSC的培养,但是这种含有鼠源性细胞的培养体系含有许多潜在的微生物感染风险,并且不可避免的带有异源细胞和蛋白,限制了hiPSC潜在的临床应用价值。因此,仍有待进一步探索“合适”或者“理想”的hiPSC诱导和扩增培养条件。我们关注于用人源性细胞作为滋养层用于hiPSC的诱导和扩增培养。 第1章人骨髓间充质干细胞作为滋养层培养hiPSC方法的建立和研究 人间充质干细胞(human Mesenchymal Stem Cell,hMSC)是一种具有多向分化潜能的成体干细胞,可以从少量的骨髓或其他许多组织样本中分离获得,可在分成纤维细胞重编程。因此,我们研究了自身成纤维细胞是否可作为滋养层支持hiPSC的诱导和扩增培养,并研究以自身成纤维为滋养层诱导培养的hiPSC的生物学特征。 我们从两个需做包皮环切术儿童手术后废弃的包皮中分离到两株包皮成纤维细胞,对二者均进行了相关研究。将HFF转导携带有Klf4、Sox2、Oct4和c-Myc转录因子的逆转录病毒后,不再作消化收集,而是在原来的体系中用hiPSC培养液一直培养。我们观察到,转导病毒后,大部分的成纤维细胞形态上并没有发生改变,且仍具有较强的增殖能力。9-10天后,小部分成纤维细胞聚集成小簇,细胞形态变短变宽,向上皮样转变,核仁明显。约3周后,部分小簇形成较大致密的克隆样细胞团块。这些克隆挑选后可继续在自身HFF滋养层上扩增,形成典型的hESC形态。表明在重编程过程中,未发生有效重编程的自身成纤维细胞可以作为滋养层支持其他成纤维细胞的重编程。 我们主要检测了扩增后其中一个克隆的特性,免疫荧光检测结果显示这些在自身HFF滋养层上培养的hiPSC表达未分化hESC特有的表面标记,如SSEA-4、 TRA-1-60、TRA-1-81和NANOG;RT-PCR检测显示内源性KLF4、SOX2、c-Myc.

Apelin-13浓度依赖性（0-1μM）和时间依赖性（0-24h）促进培养大鼠H9c2心肌细胞中自噬标志蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1的表达； 6.PI3K特异性抑制剂LY294002（25μM）和Akt特异性抑制剂1701-1（10μM）可以抑制apelin-13引起的自噬标志蛋白LC3-II/LC3-I的表达增加，但是对apelin-13诱导的Beclin1的表达增加无明显影响； 7.自噬抑制剂3-MA（5mM）抑制apelin-13诱导的培养大鼠H9c2心肌细胞内IL-8的分泌； 8. Apelin-13抑制培养大鼠H9c2心肌细胞LDH、AST分泌。 结论PI3K-自噬途径介导apelin-13促大鼠H9c2心肌细胞分泌IL-8。
目的：通过观察电针“尺泽、合谷”和“足三里、三阴交”两组穴位对脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损评分、脑组织形态学、细胞凋亡及磷酸化p38MAPK的影响,探讨电针对抗脑缺血再灌注损伤的可能作用机理,为临床应用针灸防治脑缺血再灌注提供部分实验依据。

方法：250只健康雄性SD大鼠随机分为5组：假手术组、模型组、电针组、阻滞剂组、电针+阻滞剂组,50只/组。每组大鼠依据再灌注的不同时间点,随机分为5个时间点亚组：2h组、6h组、1d组、3d组、1w组,每亚组10只。除假手术组外,其余组大鼠均采用改良线栓法制备脑缺血再灌注模型,电针组予每日1次电针治疗,阻滞剂组于造模前30min在相应脑区注射p38MAPK阻滞剂SB203580,电针+阻滞剂组造模前注射SB203580,后予电针治疗。采用神经功能缺损评分测试大鼠神经缺损症状,HE染色和TTC染色法观察大鼠脑组织形态学改变,TUNEL法检测大鼠神经细胞凋亡指数,免疫组化法检测缺血区p-p38MAPK蛋白表达情况。 GSK126细胞系 结果： 1.神经功能缺损评分比较：造模后,与假手术比较,其余四组大鼠神经缺损评分明显高于假手术组,有显著的统计学差异(p<0.01),说明脑缺血再灌注造模成功。随着缺血再灌注时间的延长,神经缺损评分呈降低趋势。治疗后,与模型组比较,电针组、阻滞剂组、电针+阻滞剂组评分均低于模型组,且各组3d及1w时间点评分降低,具有统计学意义(p<0.05),SB+EA组1w时间点评分下降,具有显著统计学意义(p0.05)。

2.HE染色观察缺血区脑细胞形态变化：假手术组细胞形态完整,结构清晰核膜完整,核仁清晰；模型组细胞间隙增宽,神经元数量减少,排列紊乱,核膜与周围分界不清,核仁固缩；电针组、阻滞剂组及电针+阻滞剂组神经组织损伤较模型组轻,细胞排列较整齐,结构较完整,胞体轻中度肿胀,存活神经元较多。

点击此处 3.TTC染色观察脑组织大体形态学改变：假手术组大鼠脑组织被染成均匀一致的红色,其余组大鼠造模后,脑组织出现大小不一的苍白色区域,差异具有统计学意义(P<0.01),随着时间的延长,梗死面积逐渐增加。与模型组比较,电针组、阻滞剂组、电针+阻滞剂组梗死面积不同程度的缩小,再灌注6h后,各组大鼠面积缩小具有统计学意义(p<0.05)。3d及1w时,阻滞剂组梗死面积较电针组、电针+阻滞剂组大(p<0.05),电针+阻滞剂组梗死面积较电针组小(p<0.01)。模型组大鼠阳性细胞数呈时间依赖性,1d时达高峰,3d减少最多,与模型组比较,电针组、阻滞剂组、电针+阻滞剂组凋亡指数均下降,多数组与模型组比较有较明显下降(p<0.05或p<0.01)。阻滞剂与电针刺激合用时,凋亡指数下降明显,与单独使用时比较,1d时间点差异具有统计学意义(p0.05)。 5.脑组织p-p38MAPK表达比较：与假手术组相比,其余四组大鼠脑组织酸化p38MAPK蛋白含量提高(p<0.05)。模型组磷酸化p38于再灌注后2h开始升高,1d显著升高,3d达到峰值,此后逐渐下降,1周时阳性细胞率仍高于假手术组。与模型组相比,电针组、阻滞剂组、电针+阻滞剂组各时段阳性率均有所下降,部分亚组差异具有显著性(p<0.05或p0.05)。 寻找更多 结论： 1.电针“合谷、尺泽”和“足三里、三阴交”两组穴位,能明显改善脑缺血／再灌注损伤大鼠的神经缺损症状及脑组织病理形态学变化,能显著降低缺血区神经细胞凋亡指数,提示电针“合谷、尺泽”和“足三里、三阴交”两组穴位对脑组织的缺血损伤具有一定的保护作用。 2.电针“合谷、尺泽”和“足三里、三阴交”能抑制磷酸化p38MAPK蛋白的表达,提示电针“合谷、尺泽”和“足三里、三阴交”对脑缺血损伤的保护作用可能是通过抑制p38MAPK信号通路的表达来完成的。 3.电针“合谷、尺泽”和“足三里、三阴交”对脑缺血／再灌注大鼠的神经功能缺损、脑组织病理形态、缺血区神经细胞凋亡指数及p-p38MAPK的改善在再灌注后3天时较明显,说明该时间点可能为促进脑缺血神经修复的较好治疗时间窗。 4.

01),二者在胃癌组织中的表达均与胃癌的分化程度、TNM分期、浸润深度、淋巴结转移情况相关(P
The current standard treatment

option for advanced hepatocellular carcinoma(HCC) is sorafenib, but its clinical benefit is modest. In spite of many attempts, few drugs can provide any significant Trichostatin A improvement of survival as the first- or second-line therapy of choice in phase Ⅲ randomized controlled trials. Recently, the subgroup analysis of a phase Ⅱ randomized controlled trial has shown that tivantinib, a selective MET inhibitor, can significantly improve the overall survival in patients with MET-positive MK-8776溶解度 advanced HCC after the failure or intolerance of a prior systemic therapy. These findings enlighten the role of MET inhibitors in the treatment of advanced HCC. In this paper, we review all ongoing and completed clinical trials regarding this topic. As for the first-line therapy of advanced HCC, INC280 and foretinib are being evaluated in 2 phase Ⅱ single-arm trials; and MSC2156119 J and golvatinib plus sorafenib are being compared with sorafenib alone in 2 phase Ⅱ randomized controlled trials.

As for the second-line therapy of advanced HCC, tivantinib and cabozantinib are being compared with placebo in 2 phase Ⅲrandomized controlled trials.
The incidence of gastric cancer(GC) fell dramatically over the last 50 years, but according to IARC-Globocan 2008, it is the third most frequent cause of cancerrelated deaths with a case fatality GC ratio higher than other common

malignancies. Surgical resection is the primary curative treatment for GC though the overall 5-year survival rate remains poor(approximately 20%-25%). To improve the outcome of resectable gastric cancer, different treatment strategies have been evaluated such as adjuvant or perioperative chemotherapy. In resected 点击此处 gastric cancer, the addition of radiotherapy to chemotherapy does not appear to provide any additional benefit. Moreover, in metastatic patients, chemotherapy is the mainstay of palliative therapy with a median overall survival of 8-10 mo and objective response rates of merely 20%-40%. Therefore, the potential for making key beneficial progress is to investigate the GC molecular biology to realize innovative therapeutic strategies, such as specific immunotherapy.

hy926,用终浓度为10、30、100、300umol/l的西洛他唑分别作用24小时并设立对照进行比较,采用MTT法确定细胞的增殖状态。 2.体外培养人脐静脉内皮细胞株EA.hy926,用不同终浓度的西洛他唑(10.30、100、300umol/l)刺激24小时并设立对照组进行比较,裂解细胞提取蛋白,考马斯亮蓝G-250染色法测定总蛋白浓度,利用P38磷酸化抗MAPK抗体的蛋白免疫印记法测定磷酸化P38MAPK蛋白表达。 3.在96孔板上体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞VSMC,用终浓度为10、30、100、300umol/l的西洛他唑分别作用24小时并设立对照进行比较,采用CCK-8法确定细胞的增殖状态。 4.体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞VSMC,用不同终浓度的西洛他唑(10、30、100、300umol/l)刺激24小时并设立对照组进行比较,裂解细胞提取蛋白,考马斯亮蓝G-250染色法测定总蛋白浓度,利用P38磷酸化抗MAPK抗体的蛋白免疫印记法测定磷酸化P38MAPK蛋白表达。

Lumacaftor 研究结果 1.采用MTT法确定人脐静脉血管内皮细胞的增殖状态：各组细胞增殖率分别为对照组0.909±0.012, CLZ10μmo/L组0.904±0.026; CLZ30μmol/L组0.851±0.023; CLZ100μmol/L组0.670±0.013; CLZ300μmol/L组0.651±0.036。统计分析显示30μmol/L、100μ mol/L和300μ mol/L的CLZ分别能明显抑制HUVECs的增殖(P0.05)。30μ mol/L100μ mol/L及300μmol/L的CLZ均能够明显抑制磷酸化P38MAPK蛋白的表达(92.5±2.4,72.6±5.2,70.6±3.3,P0.05)。100μmol/L及300μmol/L的CLZ均能够明显抑制磷酸化P38MAPK蛋白的表达(86.7±1.6,77.9±2.3,P
研究目的:

本课题拟以人皮肤微血管内皮细胞株(human dermal microvascularendothelial cells,HMVECs)为研究对象,应用细胞生物学、单层内皮细胞通透性的测定、免疫印迹和激光共聚焦显微镜观察等实验方法和技术,观察晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)修饰的人血清白蛋白(humanserum selleck kinase 抑制剂 albumin,HSA)对HMVECs骨架纤维状肌动蛋白(filamentous actin,,F-actin)形态和定位的影响,以及对单层细胞通透性的作用;选用RhoA的主导失活或组成型激活的重组腺病毒以及ROCK抑制剂处理细胞,探讨Rho/ROCK通路是否参与了AGE-HSA介导的上述细胞反应;通过免疫印迹检测RhoA和ROCK蛋白及其磷酸化水平的变化,查明RhoA、ROCK的磷酸化激活在其中的作用;为了探讨Rho/ROCK介导AGE-HSA引起内皮细胞形态和功能变化的机制,分别观察了抑制ROCK对p38 MAPK磷酸化水平的影响,以及抑制p38 MAPK磷酸化激活对RhoA、ROCK磷酸化激活的影响。通过上述研究试图阐明AGE-HSA对血管内皮细胞形态和功能的影响以及可能的信号转导通路,为进一步阐明与AGE-HSA相关的糖尿病微血管并发症发生发展的机制提供实验依据,并为其防治提供新的思路和有效手段。 研究方法: AGE-HSA由人血清白蛋白与D-葡萄糖共孵育8周制得。体外培养人皮肤微血管内皮细胞株,分别接种于微孔小皿(petri dish)、双层通透的培养皿(transwell)顶层小室微孔膜上(直径6.5 mm,孔径大小0.4μm)和6 cm细胞培养皿上,待细胞长至融合或接近融合后,换无血清培养基继续培养2 h使细胞获得同步生长,然后按实验分组分别处理备用。在各实验分组中,分别用ROCK特异性抑制剂Y-27632、H-1152或p38MPAK丝裂原激活的MAPK通路上游激酶抑制剂SB203580预处理细胞30 哪里 min后,即以不同时间或者浓度的AGE-HSA再孵育;另外,用重组腺病毒RhoA N19的无活性型突变体预转染内皮细胞24 h,继以AGE-HSA再孵育;或重组腺病毒RhoA L63的活性突变体单独转染细胞24 h。用免疫荧光染色法、激光共聚焦显微镜观察细胞骨架肌动蛋白F-actin、RhoA及其磷酸化蛋白的结构及分布改变;用免疫印迹法检测phospho-p38,RhoA和ROCK及其磷酸化水平的变化,采用多功能蛋白组学影像系统KODAK2000R直接成像,以ImageJ软件分析各组灰度值,β-actin为内参进行校正,以对照组面积灰度值为100%与实验组进行比较;用FITC荧光标记蛋白漏出法测定单层内皮细胞的通透系数Pa值,实验结果以Pa变化百分比表示,Pa%=(实验样品Pa值/对照样品Pa值)×100。

研究结果: 1.AGE-HSA对HMVECs骨架F-actin形态和单层内皮细胞通透性的影响 (1) AGE-HSA对HMVECs细胞骨架F-actin形态的影响 AGE-HSA以时间和剂量依赖的方式引起HMVECs骨架肌动蛋白F-actin结构和分布的改变,未经修饰的人血清白蛋白无此作用;正常细胞的F-actin主要分布在细胞周边,线条光滑,完整连续,界限分明。随着AGE-HSA作用时间或浓度的增加,F-actin变得毛糙不规整,出现锯齿样结构,甚至断裂、变细、崩解消散,F-actin在细胞内弥散分布,由非极性单行排列的肌动蛋白丝组成的应力纤维逐渐增多,细胞变圆、明显回缩,相邻细胞互相解离,细胞间失去正常连接结构。 (2) AGE-HSA对HMVECs通透性的影响 AGE-HSA以时间和剂量依赖的方式引起HMVECs通透性的升高。在时间效应组中,HMVECs的通透性随AGE-HSA作用时间的延长显著增高(F=186.746,P＜0.01),当AGE-HSA作用1,2,4,8,12 h时,与对照组相比,HMVECs的通透性分别增至113.97±2.68%,149.31±2.48%,169.76±6.21%,191.32±2.14%,196.14±2.43%,且从2 h起,与对照组相比有显著性差异(P＜0.05),差异有统计学意义。在剂量效应组中,随着AGE-HSA浓度的增加,HMVECs的通透性显著增加(F=344.582,P＜0.01),对照组内皮细胞的通透性为100%,当AGEs为12.5,25,50,100μg/ml时,Pa与对照组相比分别增至117.95±0.99%,152.15±4.51%,191.32±2.14%,199.23±2.54%,且从12.5μg/ml起均与对照组有显著性差异(P＜0.05),差异有统计学意义。未经修饰的HSA对内皮细胞通透性(101.57±1.29%)无明显影响,差异均无统计学意义(P＞0.05)。 2.

应用免疫组化S-P法和双酶法检测CD40-CD40L、ICAM-1-LFA-1蛋白在GO患者眼眶组织中的表达;原代培养GO患者及正常人的眼眶成纤维细胞并用免疫组化技术检测其表面的CD40和ICAM-1。 2.应用RT-PCR方法检测CD40L诱导OF合成ICAM-1的mRNA水平;应用酶联免疫吸附测定技术(ELISA)检测CD40L诱导OF合成ICAM-1的蛋白水平。 3.预先添加各种信号通路抑制剂(PD98059,SB203580,SP600125,PDTC,PP1)后,应用实时荧光定量PCR检测CD40L诱导OF合成ICAM-1的mRNA水平;应用Western-blot方法检测CD40L刺激OF引起MAPKs家族(p38、ERK1/2、JNK)的磷酸化改变;应用EMSA方法检测CD40L刺激OF引起NF-κB的活性改变。 4.应用Western-blot方法检测CD40L刺激OF引起Src家族(Syk、Lyn)的磷酸化改变;预先调加Syk激酶抑制剂(Piceatannol)后,应用实时荧光定量PCR检测CD40L诱导OF合成ICAM-1的mRNA水平;应用Western-blot、EMSA方法检测Syk激酶与MAPKs、NF-κB信号通路之间的关系。

5.构建pEGFP-C2-TSHR质粒,肌肉注射免疫6周龄雌性BALB/c小鼠(实验组15只、对照组10只),第3和6周加强免疫两次。第18周时分别处死两组小鼠,分离其甲状腺和眼眶组织行普通光学显微镜检查;摘眼球取血,以放射免疫法测定小鼠血清TT4水平,ELISA法检测血清TRAb。 因为 结果 1.免疫组化结果显示:GO组的眼眶结缔组织中可见高表达CD40、ICAM-1蛋白的成纤维细胞以及高表达ICAM-1的血管内皮细胞,可见散在分布的CD4+、CD8+淋巴细胞,大量淋巴细胞高表达LFA-1;双酶标组化显示CD40阳性表达的成纤维周围浸润CD40L阳性表达的淋巴细胞;ICAM-1强阳性的眼眶成纤维细胞与LFA-1强阳性淋巴细胞以直接接触的形式存在;在ICAM-1阳性的血管内皮细胞旁聚集大量LFA-1阳性的淋巴细胞。成功培养原代眼眶成纤维细胞。 2. RT-PCR及ELISA结果显示GO组的眼眶成纤维细胞在静息状态时,ICAM-1的mRNA水平和蛋白水平都高于正常组(P<0.05);两组的OF经CD40L诱导后ICAM-1的mRNA水平和蛋白水平都高于静息状态(P<0.01),在CD40L激活后2小时,mRNA水平达到最高值(P0.05)。 4.Western-blot结果显示CD40L激活眼眶成纤维细胞后,Src家族的两种激酶(Syk、Lyn)都发生了不同程度的磷酸化改变,Lyn的磷酸化时相要早于Syk。荧光定量PCR结果显示:Syk激酶抑制剂(Piceatannol,10μM)明显减少ICAM-1的mRNA相对表达量(P<0.05)。EMSA及Western-blot结果显示Syk激酶抑制剂(Piceatannol,10、25μM)显著性降低NF-κB的活性和IκB的磷酸化水平(P
Visfatin/Nampt是一个比较复杂的蛋白。它既被发现是哺乳动物NAD合成的限速酶,又被发现是一种主要由内脏脂肪分泌的脂肪细胞因子,具有广泛的生物学功能。首先,它控制着NAD的合成,极大地调控了生物体的各种生物学功能。另外,它还能促进细胞增殖、参与炎性应答、调节细胞分化、抗细胞凋亡、参与细胞周期,调控胰岛素分泌等等。临床研究发现,Nampt/visfatin/PBEF与多种临床疾病密切相关,如1型糖尿病、2型糖尿病、急性肺部炎症和败血症、类风湿性关节炎、肥胖和脂代谢异常、胰岛素抵抗和代谢综合征、妊娠和分娩、妊娠期糖尿病、肾病、铁代谢异常等等。在各种文章中,visfatin/

selleck化学 Nampt/PBEF这三个名字均有应用,造成了一定的混乱。Visfatin最为常用,而Nampt被HUGO基因命名法委员会和小鼠基因命名法委员会共同确认为官方命名。因此,在本文中,将一直使用visfatin/Nampt。 Visfatin/Nampt的在各种组织内均有表达,这种广泛表达性预示着其多功能性。国际上对于visfatin/Nampt在心血管系统中的作用,比如对内皮细胞的增殖,在动脉粥样硬化斑块中的作用等已经有一些报道[1-3]。但是,并没有任何关于visfatin/Nampt的直接对于血管活性是否有调节作用的报道。本课题针对visfatin/Nampt在心血管系统的作用,尤其是血管外膜脂肪和血管中层平滑肌的旁分泌作用、visfatin/Nampt在8种心血管病理动物模型上的表达变化以及visfatin/Nampt对缺血性脑卒中的保护作用,进行了详细的研究。并在此基础上,着重探讨了visfatin/Nampt促VSMC增殖和visfatin/Nampt的神经保护作用的机制。最后提出了visfatin/Nampt在PVAT和血管中层VSMC间的旁分泌作用机制和visfatin/Nampt通过LKB1-AMPK-mTOR通路发挥神经保护作用的机制。

点击此处 具体实验如下: 第一部分:在第一部分的工作中,我们主要对visfatin/Nampt在心血管系统的生理活性和功能进行探讨。我们的实验结果显示:visfatin/Nampt本身并没有血管收缩或舒张作用,不参与对血管的张力调节。血管外膜脂肪(PVAT)高表达并且可以分泌visfatin/Nampt,而PVAT分泌出来的visfatin/Nampt可以通过旁分泌作用于与血管外膜脂肪邻近的血管中膜平滑肌细胞层,并通过NMN依赖的、ERK1/2和p38介导的机制促进VSMC的增殖过程。此现象的阐明对血管生物学以及动脉粥样硬化的发生发展,肥胖、糖尿病的发病机制研究及治疗都具有一定的作用。 实验一:利用Real-Time PCR和Western blotting技术,我们在mRNA和蛋白两个水平证实visfatin/Nampt在PVAT上高表达,而且表达量比内脏脂肪还要高。另外,和大鼠类似,visfatin/Nampt在猴的PVAT上高表达,超过内脏脂肪表达量。而在浓缩的PVAT孵育液中,我们探测到了visfatin/Nampt,浓度和血清visfatin/Nampt相当。这说明血管外膜脂肪是高表达并且可以分泌visfatin/Nampt的。 实验二:Vsfatin/Nampt不影响血管收缩和舒张功能,也不影响PVAT的抗血管收缩功能。直接加入累积剂量(0.

0软件对49个2,4-二芳基氨基吡啶类似物化合物进行三维定量构效关系(3D-QSAR)研究及蛋白质分子对接(Docking)研究,用数据阐述模型的可靠性,对后续类似ALK磷酸激酶抑制剂的研究起到至关重要的作用。论文第五章,对于文章的中心思想进行了总结,阐明用计算机辅助药物设计的方法对于ALK磷酸激酶抑制剂的研究具有重大的意义。
在癌症的化疗与靶向药物的治疗过程中,普遍存在耐药性问题。目前,研究者通常通过建立耐药细胞系模型,研究耐药性机制和筛选耐药基因标志。然而,现有的耐药细胞系分析方法存在很大的缺陷,其中两个主要的问题是(1)缺乏判断耐药细胞系模型是否建立成功的金标准(gold

SB431542研究购买 standard);(2)在耐药与敏感细胞系间选择差异表达基因的方法普遍缺乏严格的统计控制。这些问题可能是导致不同研究工作找到的耐药基因表达标志不具有可重复性的重要原因。针对此问题,本文以癌细胞系耐药模型为主要研究对象,提出了一种细胞系分析方法,从多组用不同处理方法建立的耐药细胞系中筛选具有显著可重复性的耐药关键基因。本文主要研究内容分为以下两个部分:第一部分针对之前工作中采用的人为设定倍数差异(Fold Change,FC)阈值的方法存在的不确定问题,提出由技术重复细胞系样本(replicates)获得的耐药相关基因的可重复性判断的统计模型,用于评估由耐药细胞系的样本获得的差异基因的可靠性。然后,在几套培养处理模式各不相同的独立细胞系数据中分别筛选差异表达基因,并评价其差异表达模式(上、下调方向)一致的基因,将其作为耐药基因标志。最后,寻找几套数据集的差异基因富集到的具有重现性的功能类,分析耐药性影响的相关功能。在第二部分中,针对三类临床常见的癌症治疗药物(他莫昔芬、奥沙利铂和厄洛替尼)的耐药细胞系模型,我们应用上述算法分别在其中筛选耐药基因表达标志。在他莫昔芬耐药的乳腺癌细胞系中,我们确定了91个与他莫昔芬耐药相关的基因表达标志,并发现了他莫昔芬耐药性的产生主要与溶酶体、RNA运输等功能相关;在奥沙利铂耐药的结肠癌细胞系中,我们发现了20个与奥沙利铂耐药相关的基因表达标志,其耐药性的产生与mRNA修饰、碱基替换或颠换编辑相关;在厄洛替尼耐药的肺癌细胞系中,我们找到了18个与厄洛替尼耐药相关的基因表达标志,且发现厄洛替尼耐药性的产生会扰动细胞扩增相关的功能。
目的:(1)探讨碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体(b FGF单抗)联合Lobaplatin(LBP)对肺癌细胞系A549细胞增殖、凋亡和转移的影响及其可能的作用机制。(2)系统评价Lobaplatin联合化疗治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的疗效和安全性。方法:制备腹水型bFGF单抗,体外培养肺腺癌A549细胞,将细胞分为四组(control组、b

Selleck PF 2341066 FGF单抗组、LBP组及b FGF单抗+LBP组)处理48h。(1)CCK-8法测定其对A549细胞增殖的影响;流式细胞仪检测药物作用后细胞周期分布的变化,Western blot法检测细胞周期相关蛋白CDK4和cyclin D的表达水平。(2)流式细胞仪检测药物作用A549细胞凋亡,DAPI染色激光共聚焦显微镜下观察细胞凋亡过程中细胞核的变化,western blot法检测细胞凋亡PI3K/Akt信号通路有关蛋白bcl-2、caspase-3、caspase-9、PARP及BAX、cleave-caspase-3、cleave-caspase-9、cleave-PARP的表达变化。(3)划痕实验及Transwell小室检测不同药物分组对A549细胞侵袭及迁移能力的影响,Western 点击此处 blot法检测细胞侵袭迁移相关蛋白MMP-2和MMP-9的表达。(4)计算机检索Cochrane Library、Pub Med、EMBase、中国期刊全文数据库(CNKI)、中国生物医学文献数据库(CBM)、维普中文期刊数据库、万方数据库,纳入LBP联合化疗对比顺铂联合化疗治疗晚期NSCLC的随机对照试验(PCT),根据纳入与排除标准筛选后,运用改良后的Jadad量表评价纳入文献的方法学质量,并采用Cochrane协作网提供的Rev

Man5.2统计学软件进行Meta分析。结果:(1)CCK-8结果显示不同的药物分组可抑制A549细胞的增殖,并以bFGF单抗+LBP对肺癌A549细胞增殖作用最为明显,流式细胞仪检测结果发现b FGF单抗联合LBP可抑制A549细胞周期的进行,阻止细胞周期在G0/GI期。Western blot检测结果表明b FGF单抗和LBP可下调细胞内CDK4和cyclin D的表达。(2)流式细胞仪检测结果显示b FGF单抗,LBP单独及联合可诱导A549细胞凋亡。DAPI染色激光共聚焦显微镜下发现可引起细胞核固缩、核裂解。Western blot结果表明b FGF单抗联合LBP通过下调bcl-2、casepase-3、casepase-9、PARP的表达,上调BAX、cleave-casepase-3、cleave-casepase-9、cleave-PARP的表达来诱导A549细胞的凋亡。(3)划痕实验和Transwell小室基质胶实验显示b FGF单抗,LBP单独及联合可抑制A549细胞侵袭迁移能力。Western blot检测结果发现药物作用后可下调MMP-2和MMP-9蛋白表达来阻断细胞的侵袭迁移。(4)共纳入11项RCT,合计724例患者。Meta分析结果显示,试验组患者的客观缓解率[RR=0.96,95%CI(0.79,1.16),P=0.65]、白细胞减少发生率[RR=0.95.,95%CI(0.83,1.08),P=0.42]和血小板减少发生率[RR=0.96,95%CI(0.80,1.15),P=0.68]与对照组比较差异无统计学意义;但试验组患者恶心呕吐发生率[RR=0.55,95%CI(0.46,0.

JNK、p53、Bax和caspase-3在蜈蚣醇提液各治疗组的表达和对照组相比明显上调(P＜0.01),ERK和Bcl-2的表达则下调(P＜0.05)。p38的表达在蜈蚣醇提液各治疗组和对照组间无明显差异性(P＞0.05)。

2.蜈蚣醇提液各治疗组p-ERK1/2的表达水平相对于对照组明显下调(P＜0.01),抑制剂组p-ERK1/2较对照组明显下调(P＜0.01);蜈蚣醇提液各治疗组p-JNK1的表达水平相对于对照组明显上调(P＜0.01),抑制剂组p-JNK1蛋白的表达较等量蜈蚣醇提液组明显下降,但高于对照组,有显著性差异(P＜0.01);蜈蚣醇提液各治疗组p-p38的表达水平相对于对照组无明显差异性(P＞0.05),抑制剂组p-P38蛋白的表达较对照组明显下调(P＜0.01)。 Selleckchem Dabrafenib 3.相关性分析结果:ERK在蜈蚣醇提液各治疗组的表达和p53、Bax和caspase-3在蜈蚣醇提液各治疗组的表达呈负相关(r=-0.965,P＜0.01;r=-0.974,P＜0.01;r=-0.974,P＜0.01);和Bcl-2的表达呈正相关(r=0.946,P＜0.01)。JNK在蜈蚣醇提液各治疗组的表达和p53、Bax和caspase-3在蜈蚣醇提液各治疗组的表达呈正相关(r=0.913,P＜0.01;r=0.931,P＜0.01;r=0.937,P＜0.01);JNK与Bcl-2的表达呈负相关(r=-0.883,P＜0.01)。 结论: 1蜈蚣醇提液可能通过阻断ERK1/2通路和激活JNK1通路来抑制Bel-7402的增殖,诱导其凋亡。 2.ERK1/2通路抑制、JNK1通路激活后可能诱导蜈蚣醇提液各治疗组p53、Bax和caspase-3的表达上调和Bcl-2的表达下调,提示蜈蚣醇提液可能通过多途径抑制Bel-7402生长,诱导其调亡。
心肌肥厚是心脏对多种疾病包括高血压、机械负荷、心肌梗塞、心律失常、内分泌机能紊乱的适应性反应,是心脏输出做功增加的最初代偿性机制反应。持续性的心肌肥大能够引起扩张性心肌病,心衰甚至猝死。心肌肥厚是心血管疾病的独立危险因素。

影响心肌肥厚的因素主要包括:一为机械性因素,包括压力负荷与容量负荷;二为神经性与体液性因素,包括肾素–血管紧张素系统–醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone selleck

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selleck怎么样 system,RAAS)、交感神经系统、肾上腺髓质激素、甲状腺素、内皮素(ET)、心肌肥厚肽、醛固酮(ALD)、心房钠尿肽(ANP)、一氧化氮(NO)等。研究表明,RAAS对维持心血管系统功能稳定非常重要,并且在心肌肥厚发生中起重要作用。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)具有正性变力作用和强烈的血管收缩作用,能刺激细胞蛋白质合成,参与了心肌肥厚的早期信号传导。心肌肥厚包括心肌细胞体积的肥大和心肌间质细胞增殖两个最基本的过程。因此,开发一种有效的抗心肌肥厚的药物是心血管研究中的重要课题。先前实验研究表明单味蜈蚣有抗心肌缺血、抗动脉粥样硬化等作用,离体实验证实,蜈蚣的成分提取物酸性蛋白(Centipede

Acidic Protein,CAP)浓度依赖性的提高窦房结频率,增强心肌收缩力等广泛的心血管作用。 本实验通过细胞免疫化学、流式细胞术、激光共聚焦、分子生物学(Western blot,RT-PCR)等技术在整体水平研究CAP对压力超负荷性心肌肥厚模型及急性心力衰竭大鼠的作用;从细胞与分子水平研究CAP对培养的乳鼠心肌细胞凋亡及心肌成纤维细胞增殖的作用及其机制: 哪里 (1)CAP对压力超负荷性心肌肥厚的作用及机制研究; (2)CAP对AngⅡ诱导心肌细胞凋亡的影响; (3)CAP对AngⅡ诱导心肌成纤维细胞增殖的影响及其机制研究; (4)CAP对急性心力衰竭大鼠心功能的影响。 第一部分蜈蚣酸性蛋白对压力超负荷性心肌肥厚的作用及机制研究 目的:研究CAP对压力超负荷性心肌肥厚(pressure-overload induced cardiac hypertrophy,POH)模型大鼠的作用及机理。 方法:大鼠随机分为4组:假手术组(saline,1ml·100g-1,i.p.)、模型对照组(saline,1ml·100g-1,i.p.)、卡托普利组(captopril,30mg·kg-1,i.g.)、CAP干预组(CAP,2.0g·kg-1,i.p.)。采用大鼠腹主动脉缩窄术复制POH模型。于术后第8周测定心功能及血液指标,包括心率(HR)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、平均动脉压(MBP)、左室收缩峰压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、室内压最大上升速率(+dp/dtmax)、室内压最大下降速率(-dp/dtmax)、左室质量指数(LVMI)、AngⅡ、ET、ALD、ANP、NO、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)。取部分左室游离壁中段心肌组织,经全自动图象分析系统行图象分析:HE染色观察心肌病理改变并测量各组心肌细胞直径(MD);Masson染色观察心肌胶原变化并计算心肌胶原容积分数(CVF)。 结果: 1、POH组HR为384.0±21.5,SBP、DBP、MBP分别为28.12±1.75、18.24±1.18、24.78±1.27,与假手术对照组相比均有显著性差异(P<0.05或P<0.05或P<0.05或P<0.05),不同浓度的CAP(4.8mg·L-1、0.48mg·L-1)caspase-3活性分别为1.2±0.4、1.8±0.5,明显低于AngⅡ组(P<0.05或P<0.01)。AngⅡ组Bcl-2蛋白表达显著降低为11.95±3.98,与空白组相比有显著性差异(P<0.01),不同浓度的CAP(4.8mg·L-1、0.48mg·L-1)组Bax蛋白表达分别为22.26±6.53、17.34±4.05,明显高于AngⅡ组(P<0.05或P<0.01),不同浓度的CAP(4.8mg·L-1、0.48mg·L-1)组CaN蛋白表达分别为11.28±2.68、14.82±3.67,明显低于AngⅡ组(P<0.

76倍,说明C/EBPβ等均有可能是应答NGAL基因TPA反应性的核蛋白因子;进一步的特异性激酶抑制剂研究发现,MEK→ERK1/2细胞信号转导通路在TPA激活的NGAL基因转录中发挥主要作用。
背景与目的 CP 868596 p21 activated kinase1(PAK1)即p21小GTP酶活化激酶1,一类进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。PAK1是PAK家族中与人类肿瘤关系密切的成员,以二聚体形式存在,是小G蛋白Rho家族的下游靶蛋白,可被生长因子及其他胞外信号活化。多项研究提示PAK1主要还是通过影响MAPK及NF-κB等通路来发挥生物学效应。正常组织只在脑、肌肉和脾脏中检测到PAK1表达,其他组织表达很少；但在多种人类肿瘤中可见PAK1表达增高或过度活化。已有文献及我们的前期工作发现在正常肠粘膜向大肠癌的恶性演进过程中,在大肠腺瘤中就可以看到PAK1明显的高表达。这说明PAK1可能参与了大肠癌恶性演进发生的启动阶段,对大肠癌的发生发展起重要作用。而肿瘤细胞的过度生长是恶性演化启动阶段的典型事件。目前缺乏PAK1在大肠癌恶性增殖的关系及相关分子机制的研究。因此,本课题旨在研究PAK1在大肠癌增殖中的作用,并从体内和体外两方面探讨PAK1促进大肠癌细胞恶性增殖的机制。这对于明确大肠癌发生发展分子机制,为大肠癌的早期诊断和个体化治疗寻找新的分子标志都具有重要的意义。

材料和方法 1、主要材料 SW480、SW620、SW1116及LoVo大肠癌细胞株,真核细胞表达质粒pcDNA3.1-PAK1-T423E, pGPU6/GFP/Neo PAK1 shRNA, LipofectamineTM 2000, G418, PAK1、Cyclin D1、CDK4、CDK6、SAPK/JNK、phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185)等抗体,MEK1/2抑制剂U0126,p38 MAPK抑制剂SB203580,JNK抑制剂SP600125,10只SPF级BALB/c裸小鼠。 MLN2238购买 2、主要方法 2.1 PAK1 shRNA干扰载体的构建 从GenBank中选定人类PAK1编码基因PAK1

mRNA序列(NM_001128620),依照shRNA的设计原则,设计4条shRNA片段,并设计一对非相关核苷酸序列作为阴性对照,利用BLAST在EST数据库查询,均未发现与另外任何基因同源,pGPU6/GFP/Neo shRNA表达载体的制备交由上海吉玛制药有限公司完成。 2.1.2 CCK-8法检测细胞增殖 接种处理好的单细胞悬液于96孔板,每孔100μl RPMI-1640完全培养基含2000(增殖实验)或3000(增殖抑制实验)个细胞,每组设6个复孔,不同处理时间后,加入CCK-8溶液10μl,继续培养2h后在450nm波长下,酶联免疫分析仪测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横轴,光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线,实验重复两次,数据以mean±SD表示。2.2流式细胞术检测细胞周期 AUY-922 价格 将经过血清饥饿同步化之后或者SP600125处理的细胞用0.25%胰酶将细胞从培养瓶底消化下来,1200转离心5min。用lxBuffer A洗涤细胞一次(2000转,5min),收集并调整细胞浓度为1×106/mL。细胞加9倍体积预冷的70%乙醇,于20℃固定24小时。离心收集细胞后,用1xBuffer A洗细胞以除去乙醇,细胞重悬于500μl BufferA中。加入12.5μl RNaseA(终浓度为0.25mg/ml),37℃反应30min。加入5μl PI室温避光染色30min。流式细胞仪激发波长488nm处检测细胞周期含量。 2.3流式检测细胞凋亡 用0.25%胰酶将LoVo细胞的干扰组及对照组细胞从培养瓶底消化下来,1200转离心5min,细胞计数；各组细胞以1×105细胞/孔接种于6孔板,每组设3个复孔；接种后24h细胞密度为80%时,更换培养基,各孔加入0.2%FBS的低血清培养基饥饿48h诱导细胞凋亡；血清饥饿法诱导细胞凋亡48小时后,用0.25%胰酶(不含EDTA)将六孔板上的细胞消化下来(消化时间不易过长,否则容易引起假阳性)；用PBS洗涤细胞二次(2000转离心5min),收集1-5×105细胞；吸取500ul

1X Binding Buffer加入到细胞悬液里；然后加入5μl的Annexin V-PE和10μl的7-AAD；室温、避光、反应5-15min；流式细胞仪检测细胞凋亡率。2.4软琼脂克隆形成实验 用RPMI 1640配制5%琼脂糖(Gibco)高压消毒备用,用前加热到到凝胶完全融化并50℃保温,加37℃预热的含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液到工作浓度；底层琼脂糖凝胶中琼脂糖终浓度为0.5%,每直径3.5cm的培养皿加1ml上层凝胶琼脂糖终浓度为0.33%,余同底层胶,直径3.5cm的培养皿加1 ml；细胞悬液制备：取对数生长期的各组细胞,0.25%胰酶消化,镜下计数,加入到上层凝胶到浓度为500/ml,每孔约500个细胞每种细胞设三个平行对照,以转染空载体的LoVo为阴性对照；凝胶在室温完全凝固后,培养皿加含双抗的10%FCSRPMI-1640 2ml,37℃5%CO2培养。每3-4天拿出培养皿冷却到室温,更换培养基,至21天终止。结果判定：大于50个细胞的克隆为有效克隆,计算有效细胞克隆数并分析结果。2.

d灌胃给药，NC组和DM组灌予相应量的生理盐水。8周后收集大鼠血、尿，检测血浆胰岛素(fasting insulin FINS)、甘油三酯（triglyceride TG）、胆固醇（cholesterol TC）、空腹血糖(fasting peripheral bloodglucose FBG)、糖化血红蛋白A1c (glycosylated hemoglobin A1c HbA1c)、尿白蛋白/尿肌酐(urinary albumin/creatinine ratio ACR)、尿视黄醇结合蛋白(urinary

retinolbinding-protein URBP)，处死大鼠留取肾脏标本计算肾脏肥大指数，应用免疫组化检测肾组织中磷酸化P38MAPK（phosphorylation of P38MAPK P-P38MAPK）及P38MAPK蛋白表达水平，应用逆转录聚合酶链反应(reversetranscription-polymerase Fludarabine体内 chain reaction RT-PCR)对肾脏组织中的P38MAPK mRNA进行半定量测定。光镜和电镜进行病理学检查，观察肾脏组织结构变化。 结果 1. DM组和PIO组大鼠的FBG水平和HbA1c值均明显高于NC组（P0.05）；PIO组的FINS与DM组相比明显降低（P0.05）。DM组和PIO组大鼠的TC和TG水平均明显高于NC组（P<0.01），而PIO组的TC和TG水平较DM组明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；PIO组上述指标值较DM组均明显降低，差异有统计学意义（P<0.01），PIO组较DM组明显减弱，差异有统计学意义（P
目的：研究孕早期母体接受氯胺酮、丙泊酚全身麻醉对SD大鼠子代海马区NR2B mRNA表达的影响，以阐明其对子代学习记忆的影响机制。 17-AAG化学结构 方法：清洁级雌性SD大鼠210只，70日龄左右，体重180-220g，随机分为氯胺酮麻醉组（K组）、丙泊酚麻醉组（P组）和对照组（C组）3大组，于孕5-7天，分别用氯胺酮和丙泊酚对K组和P组进行麻醉，对照组只给等体积的生理盐水。根据麻醉时间不同又分别将K组和P组动物分别分为2小时亚组(K2、P2亚组）、4小时亚组（K4、P4亚组）和8小时亚组（K8、P8亚组），C组及各亚组动物数均为30只，子鼠出生后30天用Morris水迷宫试验对其学习记忆功能进行测定。于水迷宫实验结束后第二日处死子鼠，取大脑海马组织，用RealTime

PCR荧光探针法分析子鼠NR2B mRNA表达水平。 结果：K组各亚组（包括K2、K4、K8亚组）子鼠逃避潜伏期均明显较C组子鼠长（p﹤0.05）。K2、K4、K8亚组间子鼠逃避潜伏期无明显差异（p＞0.05）。但K8亚组逃避潜伏期明显延长的出现时间最早且持续时间最长，K4亚组其次，K2亚组最晚且持续时间最短。K2亚组、K4亚组和K8亚组子鼠穿越平台次数分别为1.89±0.37、1.78±0.46和1.79±0.47次，均明显较C组子鼠（2.96±0.62次）少（P<0.05）。K2亚组、K4亚组和K8亚组子鼠在第二象限活动时间分别为26.63±3.96、26.54±4.57和27.57±4.01s，均明显较C组子鼠（31.84±3.74s）短（P<0.05）。K2、K4、和K8亚组间，子鼠穿越平台次数和第二象限活动时间均无明显差异（p＞0.05）。P2亚组子鼠逃避潜伏期与C组子鼠相比，无明显差异（p＞0.05）；P4亚组、P8亚组子鼠逃避潜伏期较C组子鼠长（p﹤0.05）。P2、P4、P8亚组间，子鼠逃避潜伏期差异不明显（p＞0.05）。P2亚组子鼠穿越平台次数及第二象限活动时间均与C组子鼠无明显差异（P＞0.05）。P4亚组和P8亚组子鼠穿越平台次数分别为1.93±0.45次和2.24±1.00次，均明显较C组子鼠（2.96±0.62）少（p﹤0.05）；P4亚组和P8亚组子鼠在第二象限活动时间分别为25.35±4.42s和26.89±2.74s，均明显较C组子鼠（31.84±3.74s）短（P
目的：观察异丙酚对大鼠内毒素性脑损伤的影响，并探讨其作用机制。

selleck合成 方法：健康清洁级SD大鼠72只，周龄6周，雌雄不限，体重200~250g，随机分为3组(n=24)：对照组（C组）、LPS组(L组)和异丙酚组（P组）。L组和P组由左颈内动脉注射LPS1mg/kg制备内毒素性脑损伤模型，P组在给予LPS后立即通过腹腔注射给予异丙酚(100mg/kg)，C组分别于左颈内动脉和腹腔注射与LPS和异丙酚等容量生理盐水。分别于腹腔给药后6、24、48和72h处死6只大鼠，取大鼠大脑皮质组织，测定脑组织含水量，Westernblot法检测脑组织HMGB1和磷酸化p38MAPK表达水平，免疫组化法检测脑组织NF-κBp65和iNOS表达水平，光镜下观察脑组织形态及病理学变化。 结果：与C组比较，L组各时点脑组织含水量升高，脑组织HMGB1、磷酸化p38MAPK、NF-κBp65和iNOS表达上调,且HMGB1、磷酸化p38MAPK、NF-κBp65和iNOS表达水平均于6h开始增加，24h达高峰，48h及72h各指标仍高于C组(P<0.

028)；血管内皮生长因子A在两组的相对表达量分别为0.6904±0.1032和0.7411±0.1007,两组血管内皮生长因子A的表达量无显著性差异(t=-0.786,P=0.454)。结膜下注射50μmol/L SB203580能抑制磷酸化p38表达；而对血管内皮生长因子A的表达无明显影响。 4.病理学及免疫组织化学染色结果术后7d,50μmol/L SB203580组角膜各层排列整齐,新生血管管腔细小、密度低,炎性细胞浸润少, CD31染色结果：强表达于新生血管管腔内皮细胞,排列尚规整,角膜内皮细胞弱表达；而生理盐水组角膜大量血管样结构,管腔较大、较多,炎性细胞浸润多且分布无规则,进一步CD31染色：大量阳性细胞分布于新生血管,排列杂乱,部分炎性浸润细胞亦有较强表达。

结论 1.结膜下注射50μmol/L SB203580显著抑制大鼠角膜新生血管生长。 2.结膜下注射50μmol/L SB203580抑制磷酸化p38的表达,即抑制p38的激活；而对大鼠角膜VEGFA的表达无显著影响。 3.SB203580抑制炎症反应,抑制炎性细胞在角膜的浸润。 4.进一步证实p38信号转导通路和大鼠角膜新生血管调控相关。 5.靶向p38阻断可能是角膜新生血管治疗的新策略。 第四部分可溶性血管内皮生长因子受体2对血管化大鼠角膜磷酸化p38表达的影响 目的 采用可溶性血管内皮生长因子受体2阻断血管内皮生长因子与其受体的结合,研究其是否能抑制大鼠角膜新生血管生长,并进一步探讨其是否参与p38信号转导通路的激活,最终分析p38信号转导通路参与调控角膜新生血管是否与血管内皮生长因子途径相关。 方法 1.建立大鼠角膜新生血管模型采用缝线法建立SD大鼠右眼角膜新生血管模型,将缝线后的大鼠随机分为两组：可溶性血管内皮生长因子受体2结膜下注射组和生理盐水结膜下注射组,每组8只。 BMS-907351浓度 2.结膜下注射依据分组从术后第1日开始用药,分别结膜下注射不同药物,每日1次,共7d。 3.临床观察每日在显微镜下观察角膜缝线后角膜透明度、上皮完整性、缝线数量以及是否存在角膜感染,并重点观察角膜新生血管情况。 4.计算后缝线后7d两组角膜新生血管面积显微镜下测量角膜新生血管的长度并计算角膜新生血管面积。 5.Western Blot检测两组大鼠角膜p38和磷酸化p38的表达缝线后7d,各组分别随机选取5只,摘取角膜,收集角膜蛋白,采用Western Blot方法检测各组角膜p38和磷酸化p38的表达。 6.病理学及免疫荧光检查各组随机选取3只角膜,常规多聚甲醛固定,行病理学检查；修复抗原后行免疫荧光检测p38和磷酸化p38的分布。

7.统计学分析采用SPSS13.0软件分析,计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用T检验,所有统计推断均采用双侧检验,检验水准a=0.05。 结果 1.动物观察生理盐水对照组,在观察过程中,睫状充血明显,新生血管管腔较粗且生长较快,缝线后7日,大量密集网状新生血管跨越角膜缝线处。而可溶性血管内皮生长因子受体2组在观察 Androgen Receptor Antagonist细胞系 2.角膜新生血管面积结果可溶性血管内皮生长因子受体2结膜下注射组和生理盐水注射组大鼠角膜新生血管面积分别为3.87±0.73和6.94±0.92mm2,可溶性血管内皮生长因子受体2结膜下注射组显著低于生理盐水结膜下注射组(t=-7.343,P=0.000)。 3.Western Blot结果可溶性血管内皮生长因子受体2结膜下注射组和生理盐水组大鼠角膜p38的相对表达量分别为0.6179±0.1334和0.6038±0.1484,两组p38表达无显著性差异(t=0.158,P=0.878)；两组磷酸化p38的相对表达量分别为0.2667±0.0642和0.4771±0.1171,可溶性血管内皮生长因子受体2结膜下注射组显著低于生理盐水注射组(t=-3.523,P=0.008)。结膜下注射可溶性血管内皮生长因子受体2抑制p38激活。

4.病理学和免疫荧光检查结果术后7d,可溶性血管内皮生长因子受体2结膜下注射组角膜各层排列整齐,新生血管管腔细小、密度低；而生理盐水组角膜见大量血管样结构,管腔较大、较多,炎性细胞浸润杂乱。两组p38免疫荧光检测分布基本一致,多位于细胞浆；而磷酸化p38强表达在生理盐水组,定位均在细胞核内。 已经 结论 1.结膜下注射可溶性血管内皮生长因子受体2抑制大鼠角膜新生血管生长。 2.结膜下注射可溶性血管内皮生长因子受体2抑制大鼠角膜血管化进程中p38信号转导通路的激活,下调磷酸化p38的表达。 3.p38与血管内皮生长因子所介导的信号转导过程既互相联系、偶有协同,又相对独立、各自作用；在纷繁复杂的细胞信号转导网络中,二者可能不是简单的线性排列关系。
目的：炎症因子白介素6（IL-6）在包括糖尿病视网膜病、葡萄膜炎等多种眼科炎症性疾病中起重要作用，可能成为下一个潜在的治疗靶点。视网膜Müller细胞是眼内贯穿视网膜全层的重要细胞，是各种炎症因子分泌的主要来源，对眼内炎症的调节起到了重要作用。然而，视网膜Müller细胞IL-6的表达及其调控机制尚未清楚。本实验目的在于借助于视网膜Müller细胞系（MIO-M1）细胞，深入研究并阐述视网膜Müller细胞IL-6的表达及其调控机制。 方法：为找到引起视网膜Müller细胞IL-6表达的最强潜在因素，本实验用不同的刺激：IL-1β（10ng/mL），TNF-α（10ng/mL），IL-6（10ng/mL），IL-8（10ng/mL），VEGF（10ng/mL），IFN-γ（10ng/mL），Glucose（50mM），Mannitol（50mM）处理MIO-M1细胞24h，Western Blot技术检测MIO-M1细胞内IL-6的蛋白改变。 为进一步明确IL-1β对视网膜Müller细胞在mNRA水平和蛋白水平对IL-6的调控作用，不同浓度的IL-1β （0,0.1,1,10ng/mL）刺激MIO-M1细胞24h或者IL-1β（10ng/mL）刺激MIO-M1细胞不同时间（0,2,6,12,24h），随后分别用Western Blot技术检测细胞内IL-6的mRNA和IL-6蛋白表达改变。不同浓度的IL-6（0,0.