38±0.41,1.10±0.22,1.50±0.50,1.60±0.89,每1000个细胞)明显低于Con组(3.60±0.89,每1000个细胞),(p
目前,肿瘤多药耐药(multi-drug Osimertinib细胞系 resistance, MDR)已成为肿瘤治疗中面临的一大难题,所谓肿瘤MDR是指肿瘤接触了某些抗癌药物后产生对其他多种未接触过的、结构无关和作用机制完全不同的抗癌药物也具有交叉耐药性。肿瘤MDR产生的机制十分复杂,主要包括：细胞凋亡敏感性降低、细胞存活信号通路的异常活化、药物外排泵ABC转运蛋白(P-glycoprotein,

P-gp等)过表达、药物作用靶点的改变、DNA损伤修复活性增强、药物解毒与消除酶活性增强或过表达等。 肿瘤MDR逆转剂是通过抑制转运蛋白的功能或表达,恢复耐药肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。与此不同,抗耐药药物则是通过直接杀伤或抑制耐药肿瘤克服肿瘤MDR。近年来,抗耐药研究越来越受到人们的重视。我国天然产物资源丰富,从天然产物及其衍生物中寻找新型抗耐药化合物或肿瘤MDR逆转剂具有广阔的前景。在此,我们发现汉防己甲素新型衍生物H1在体内、外均显示出良好的抗耐药作用,而且在无毒浓度时能显著逆转P-gp所介导的肿瘤MDR,并对其分子机制进行了初步探讨。 本论文主要分为两部分：第一部分,H1抗耐药药效学评价及其分子机制研究；第二部分,无毒浓度H1逆转P-gp介导的肿瘤MDR作用及对P-gp表达与功能的影响。 第一部分H1抗耐药药效学评价及其分子机制研究 本部分实验主要研究了汉防己甲素新型衍生物H1体内、外抗耐药作用及其对敏感株、耐药株细胞凋亡通路与存活信号通路的影响。采用MTT比色法测定H1对8株不同组织来源肿瘤细胞的细胞毒活性,再以KB、KBv200; MCF-7、MCF-7/adr;A549、A549/tax亲本与其相应的耐药细胞为研究对象,以三种常用的抗肿瘤药物阿霉素(ADR)、紫杉醇(TAX)、长春新碱(VCR)为对照,系统评价了H1体外抗耐药作用。建立敏感性KB、耐药性KBv200裸鼠移植瘤模型,以VCR为阳性对照药,结合KB裸鼠移植瘤模型考察KBv200裸鼠移植瘤模型的体内耐药性,进而采用KB、KBv200裸鼠移植瘤模型评价H1低、中、高(10、15、20mg/kg)三个剂量的抗肿瘤效果,评价H1体内抗耐药作用。PI单染法流式细胞仪检测H1对敏感株细胞KB、耐药株细胞KBv200细胞周期的影响。采用DAPI染色法观察细胞形态学变化；琼脂糖凝胶电泳分析细胞DNA片段化状态；PI-AnnexinV双染法定量检测H1诱导KB、KBv200细胞凋亡作用。JC-1染色法检测H1对KB、KBv200细胞线粒体膜电位的影响。H1处理KB、KBv200细胞24h后,Western

blot方法检测内源性凋亡通路相关蛋白：Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved Caspase-3的表达及线粒体膜间隙蛋白细胞色素-C、AIF的释放；外源性凋亡通路相关蛋白：Fas、FasL、Caspase-8的表达；以及细胞存活性信号通路PI3K-AKT、MEK-ERK中关键分子p-ERK、ERK、p-AKT、AKT的表达。与此同时,以Bel7042/5-Fu细胞为研究对象,以5-Fu为对照,评价了Bel7042/5-Fu细胞的耐药特性及H1对Bel7402/5-Fu与Be17402细胞的生长抑制作用。采用Trizol法提取了Bel7402、Bel7402/5-Fu细胞及H1(4μM)处理细胞24h后的mRNA,以琼脂糖凝胶电泳进行RNA质量检测。采用Affimatrix基因表达芯片平台分析敏感株细胞Be17402,耐药株细胞Bel7402/5-Fu,以及H1处理后Bel7402、Bel7402/5-Fu细胞全基因组表达水平变化。 很少 研究结果显示：H1对8株不同组织来源的肿瘤细胞都具有不同程度的生长抑制作用,IC50在1-4μM之间,对KB、Bel7402的生长抑制作用较为显著,1C50分别为1.068±0.017、0.671±0.026(μM)。体外抗耐药作用研究显示H1不仅对敏感株细胞具有较好的杀伤作用,而且对耐药株细胞也同样具有显著的抑制作用,平均耐药因子(resistant

哪里 factor, RF)仅为1.6,而三种抗肿瘤药物’TAX、ADR、VCR的平均耐药因子分别为：22.6、71.7、52.3。可见,在体外H1具有良好的抗耐药作用。KB、KBv200裸鼠移植瘤实验表明：在敏感性KB裸鼠模型,VCR给药组的相对肿瘤体积抑制百分率、瘤重抑制百分率分别为：84.4%、82.1%,显示出良好的抗肿瘤效果。但在耐药肿瘤模型(KBv200裸鼠移植瘤模型)VCR给药组的相对肿瘤体积抑制百分率、瘤重抑制百分率则分别为：12.6、27.7%,KBv200细胞在体内仍然对VCR展现良好的耐药作用,证明建立的体内耐药移植瘤模型是成功的。H1无论在敏感性KB裸鼠移植瘤还是在耐药性KBv200裸鼠移植瘤模型都具有显著的抗肿瘤效果,并且显示良好的剂量依赖关系。尤其是H1高剂量组(即20mg/kg)对敏感株KB裸鼠移植瘤的相对肿瘤体积与重量抑制百分率分别为79.7%、79.0%；对耐药株KBv200裸鼠移植瘤的相对肿瘤体积与重量抑制百分率分别为61.5%、74.9%。可见,H1在我们建立的体内移植瘤耐药模型中仍具有良好的抗耐药作用。作用机制显示：H1对KB、KBv200细胞周期分布无显著影响,但我们观察到随着H1浓度的增加出现凋亡峰(Sub-G1)。DPAI染色显示细胞核皱缩、碎裂、染色加深,且凋亡细胞的百分率随着H1浓度的升高而增加。琼脂糖凝胶电泳检测到典型的DNA片段化(DNALadder)现象。PI-AnnexinV染色后发现H1诱导KB细胞的凋亡作用略强于耐药株细胞KBv200,8μM Hl处理组诱导KB细胞晚期凋亡百分率为85.4%,而诱导耐药细胞KBv200细胞晚期凋亡的百分率为42.

人参皂苷Rg1对脑缺血再灌注的保护作用

点击此处 (1)假手术组、模型组、人参皂苷Rg1 10、20、40 mg/kg组和阳性药物对照组神经功能评分分别为0.00±0.00、2.80±0.58、1.96±0.74、1.52±0.82、1.24±0.72、1.44±1.00;与模型组比较,人参皂苷Rg1各组神经功能缺损症状显著改善(P＜0.05);Rg110 mg/kg组大鼠神经功能缺损症状虽然减轻,但与阳性药物对照组比较仍有显著性差异(P＜0.05),而20、40 mg/kg组与阳性药物对照组比较无统计学差异(P＞0.05);Rg1组间比较有显著性差异(P＜0.05),其中以Rg1 40 mg/kg组改善神经功能缺损症状的程度最为明显。 (2)假手术组、模型组、人参皂苷Rg1 10、20、40 mg/kg组和阳性药物对照组脑梗死体积百分比分别为(0.00±0.00)%、(36.20±5.77)%、(27.86±3.72)%、(20.24±3.37)%、(15.72±2.83)%、(18.08±3.78)%;Rg1各组脑梗死体积显著缩小,与模型组比较有显著性差异(P＜0.05);Rg1 10 mg/kg组大鼠脑梗死体积虽然减少,但与阳性药物对照组比较仍有显著性差异(P＜0.05),而20、40 mg/kg组与阳性药物对照组比较无统计学差异(P＜0.05);Rg1 20、40 mg/kg组与10 mg/kg组比较均有显著性差异(P＜0.05),其中以Rg1 40 mg/kg组脑梗死体积减少的程度最为明显。 (3)假手术组、模型组、Rg1 10、20、40 mg/kg组和阳性药物对照组脑组织含水量分别为(77.77±1.50)%、(83.42±2.75)%、(81.78±1.10)%、(80.77±0.76)%、(78.80±0.78)%、(81.13±1.64)%;Rg1 20、40 mg/kg组脑组织含水量显著减少,与模型组比较有显著性差异(P＜0.05),其中以40 mg/kg组脑水肿减轻的程度最为明显;Rg1 10mg/kg组大鼠脑组织含水量虽然减少,但与模型组比较无显著性差异(P＞0.05)。 (4) Rg1各组右侧海马CA1区细胞排列较整齐,间质水肿程度减轻,神经元胞体肿胀减轻,与模型组比较各项病理改变均有不同程度的改善。 Protein Tyrosine激酶抑制剂 2.人参皂苷Rg1抑制脑缺血再灌注大鼠海马CA1区的神经元凋亡 (1)模型组部分神经元坏死,也可见不同时期的神经元凋亡,有时可见凋亡小体形成;Rg1各组与模型组比较,粗面内质网肿胀及线粒体嵴断裂程度均有不同程度的减轻,可见少量早期凋亡细胞,中晚期凋亡细胞较少见。

(2)假手术组、模型组、Rg1 10、20、40 mg/kg组和阳性药物对照组海马CA1区神经元凋亡率分别为(1.91±1.46)%、(22.80±5.15)%、(17.08±3.15)%、(14.45±3.22)%、(9.70±1.91)%、(12.42±1.93)%;Rg1各组海马CA1区的凋亡细胞数量显著降低,与模型比较有显著性差异(P＜0.05);Rg1

10、40 mg/kg组与阳性药物对照组比较均有显著性差异(P＜0.05),其中40 mg/kg组抑制凋亡的程度显著优于阳性药物对照组,而20mg/kg组与阳性药物对照组比较无统计学差异(P＞0.05)。 (3)假手术组、模型组、Rg1 10、20、40 mg/kg组海马CA1区存活神经元计数分别为每高倍视野71.57±9.37、45.77±8.11、50.20±10.21、54.37±8.50、59.77±7.88、56.50±8.91;Rg1 20、40 mg/kg组神经元存活数量得到不同程度地提高,与模型组比较有显著性差异(P＜0.05),而Rg1 10 mg/kg组神经元存活数量虽然有所增高,但与模型组比较无显著性差异(P＞0.05);Rg1各组与阳性药物对照组比较无统计学差异(P＞0.05)。 (4)假手术组、模型组、人参皂苷Rg1 10、20、40 mg/kg组和阳性药物对照组海马CA1区Bcl-2蛋白表达含量分别为1.54±0.06、1.39±0.76、1.72±0.21、2.76±0.15、4.31±0.89、3.11±0.19,Bax蛋白表达含量分别为0.30±0.07、4.31±0.55、2.21±0.12、1.80±0.20、0.93±0.08、1.57±0.09;免疫组织化学与免疫印迹结果显示Rg1 selleck screening library 20、40mg/kg组Bcl-2蛋白表达量显著增强,Rg1各组Bax蛋白含量显著降低,Bcl-2/Bax比值显著提高,与模型组比较有显著性差异(P＜0.05)。 (5)人参皂苷Rg1 10、20、40 mg/kg组和阳性药物对照组海马CA1区FAS蛋白表达含量分别为0.28±0.05、3.01±0.24、1.76±0.12、1.51±0.60、1.31±0.13、1.53±0.15,FAS-L蛋白表达含量分别为0.14±0.02、0.86±0.19、0.72±0.06、0.62±0.16、0.29±0.09、0.52±0.18;Rg1各组FAS、FAS-L平均灰度明显增高(表达量减少),蛋白含量显著降低,与模型组比较有显著性差异(P＜0.05),其中40 mg/kg组FAS、FAS-L蛋白含量最低;10 mg/kg组与阳性药物对照组比较有显著性差异(P＜0.05),而20、40 mg/kg组与阳性药物对照组比较无统计学差异(P＞0.05)。 3.

05）。通过相应信号通路抑制剂添加发现p38磷酸化被抑制后IL-8mRNA表达及因子分泌水平极显著降低（p
研究背景 Selleck INK1197 卵巢癌目前是死亡率最高的妇科肿瘤疾病,发病隐匿、高复发及易扩散转移是其重要的临床特征。越来越多的研究证明，恶性肿瘤组织中存在着一小部分拥有干细胞样细胞性质的群体，即肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）或称为肿瘤干细胞样细胞（cancerstem-like cells，CSLCs），其在肿瘤的发生、发展、复发及侵袭转移中起着十分重要的作用。在卵巢癌中也存在着肿瘤干细胞，即卵巢癌干细胞（ovarian cancer stem cells，OCSCs），其对卵巢癌的发生、发展、复发及转移同样具有重要作用。因此，从卵巢癌干细胞样细胞这一角度进行研究是治疗卵巢癌的新策略。 肿瘤干细胞与普通肿瘤细胞相比，除了具有更强的侵袭、转移能力，更强的化疗抵抗能力以外，最本质的差别是其具有干细胞特性，即自我更新（self-renewal）。不管是肿瘤的发生还是复发和转移灶的形成，都有赖于肿瘤干细胞的自我更新能力。因此，阐明肿瘤干细胞的自我更新机制是研究肿瘤干细胞的关键。

肿瘤干细胞的自我更新不仅依赖于其自身内在的信号调控，同时也受到肿瘤微环境的调控，其中，肿瘤相关性炎症最为关键。然而肿瘤相关性炎症对卵巢癌干细胞的自我更新调控作用及机制却缺乏系统深入的研究。 我们前期从卵巢癌中成功分离出的CD133+卵巢癌干细胞样细胞（CD133+ovariancancer stem-like cells，CD133+OCSLCs）具有肿瘤干细胞的特性，其能够作为我们研究卵巢癌干细胞自我更新生物学特性的模型。为此，本课题探讨肿瘤相关性炎症对CD133+OCSLCs自我更新的调控作用及其机制。

Selleckchem GDC 0449 研究目的 1．检测CD133+OCSLCs相关性炎症因子及其受体的表达。 2．明确IL-17在CD133+OCSLCs自我更新中的作用。 3．阐明IL-17调控CD133+OCSLCs自我更新的机制。 研究方法 围绕上述研究目的，我们采用以下研究方法： 一、CD133+OCSLCs相关性炎症因子及其受体 1．通过人炎症反应PCR芯片（Human Inflammatory Response PCR Array）技术，比较A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs和非OCSLCs(CD133-A2780卵巢癌细胞系细胞)中炎症因子和相关受体mRNA的表达。 2．通过流式细胞、免疫荧光技术验证IL-17R在A2780卵巢癌细胞系，A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs和人卵巢癌组织中的表达情况。 二、IL-17在CD133+OCSLCs自我更新中的作用 1．通过免疫组化，免疫荧光技术检测IL-17的来源细胞。 2．通过肿瘤干细胞成球实验及受体阻断实验研究IL-17体外对A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs和原代卵巢癌细胞来源的CD133+OCSLCs自我更新的作用。 3．通过构建IL-17过表达慢病毒后裸鼠体内荷瘤实验研究IL-17对A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs体内成瘤能力的影响。 三、IL-17调控CD133+OCSLCs自我更新作用的机制 1．通过全基因组表达谱芯片技术筛选IL-17调控A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs自我更新的相关基因并通过qPCR验证。 Dorsomorphin分子重量 2．结合自我更新相关基因和生物信息学方法筛选IL-17下游信号通路。 3．通过western-blot，免疫荧光和抗体阻断等方法研究NF-κB及p38MAPK两条信号通路在IL-17调控CD133+OCSLCs自我更新中的作用。 研究结果 1．CD133+OCSLCs表面表达IL-17R 我们通过PCR-array技术，比较了A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs和非OCSLCs之间的基因差异，结合这些差异基因的生物学作用，我们选择对IL-17参与CD133+OCSLCs自我更新进行深入研究。

免疫荧光和流式细胞技术结果显示A2780卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs表面表达IL-17R并且其表达高于非OCSLC。在新鲜人卵巢癌组织中，通过免疫荧光发现IL-17R表达于原代卵巢癌来源的CD133+OCSCs表面。提示IL-17与CD133+OCSLCs具有相互作用的物质基础。 2．IL-17促进CD133+OCSLCs自我更新 因为IL-17R需要与其配体IL-17相结合才能发挥功能，因此我们首先通过免疫组化检测发现人新鲜卵巢癌组织中存在表达IL-17的细胞，其主要分布于卵巢癌间质内。免疫荧光进一步证实：表达IL-17的细胞主要为CD4+T细胞和CD68+巨噬细胞，并且这类细胞与CD133+OCSLCs在人卵巢癌组织中处于同一niche之中。提示IL-17与CD133+OCSLCs具有空间上相互作用的可能性。 通过衡量A2780卵巢癌细胞系和原代卵巢癌细胞来源的CD133+OCSLCs在IL-17刺激后的成球数量和成球大小，证明IL-17具有促进CD133+OCSLCs自我更新的作用，经过IL-17R抗体阻断实验进一步证明IL-17促进CD133+OCSLCs自我更新的作用依赖于IL-17R。 通过慢病毒介导的基因转染方法建立稳定表达人IL-17的CD133+OCSLCs，结合免疫荧光和ELISA验证IL-17转染效率，成球和受体阻断功能实验验证IL-17转染后促进CD133+OCSLCs自我更新。通过裸鼠体内荷瘤实验证明IL-17具有促进CD133+OCSLCs体内成瘤的能力。 3．IL-17通过NF-κB和p38MAPK两条信号通路调控CD133+OCSLCs自我更新 通过基因表达谱芯片比较IL-17刺激和未刺激的卵巢癌细胞系来源的CD133+OCSLCs差异基因，在此基础上分别通过:1.筛选出8个自我更新相关基因，qPCR验证后，通过在线转录因子查找的方法，证实p65和/或AP1为8个自我更新相关基因的转录因子（除TCL1A）；2.

CD8+Treg、NKTTreg和双阴性Treg细胞四大类。其中,CD4+CD25+Treg细胞是目前研究最为广泛的Treg细胞。CD4+CD25+Treg细胞除表达CD25分子外,还表达一系列免疫调节相关的标志物,如细胞表面的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic

ATM激酶抑制剂 花费 T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(Glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor, GITR)家族相关基因和细胞核内的叉头／翼状螺旋转录因子P3(Forkhad box P3, Foxp3)。Foxp3是Treg细胞维持自身免疫平衡所必需的分子。体内和体外实验都已证明,转化生长因子β1(Transforming growth factor β, TGF-β1)可诱导CD4+T细胞表达Foxp3,形成具有免疫抑制功能的Treg细胞。 丫δ T细胞因其表面表达由γ链和δ链组成的T细胞受体(T cell receptor, TCR)而得名,在抗原识别和免疫应答中具有特殊的作用。γδT细胞主要分布于皮肤、小肠、肺和生殖器官等粘膜及皮下组织,而在人类外周血中,TCR γδ约表达于0.5%-10%的CD3+T细胞表面。γδ T细胞又根据δ链的不同分为V81T细胞和V82T细胞两种类型。Vδ1T细胞多位于小肠上皮组织中,是小肠上皮内淋巴细胞(Intestine intraepithelial lymphocytes, iIELs)的重要组成部分,而其在外周血中的数量仅为γδT细胞总量的20%；V82T细胞主要见于外周血,约占γδT细胞总量的70%。Vδ2T细胞具有显著的细胞毒性作用和对微生物重复感染的记忆反应功能。由于人类外周血中V81T细胞含量较少,并且体外扩增存在一定难度,因此对外周血中Vδ1T细胞的生物学特性和功能知之甚少。iIELs主要位于小肠绒毛柱状上皮内,为一类组织松散的浸润性淋巴细胞。iIELs由于数量众多并在粘膜免疫防御中具有重要作用,因而成为IELs研究的热点之一。iIELs的表型和功能呈现多样性,依据表面TCR组成的不同分为αβ T细胞和γδ T细胞。前者具有显著的细胞毒活性,因而参与小肠粘膜的免疫应答反应；后者的功能尚未完全明确,但已有的研究显示该细胞功能具有多样性,包括免疫防御、细胞毒活性等。而最近更多的研究显示,γδT细胞具有免疫调节潜能。因此,本文将针对这一科学问题展开相关研究。

本研究旨在验证人外周血单个核细胞(Peripheral blood monouclear cells, PBMCs)来源的Vδ1T细胞以及小鼠iIELs来源的γδ T细胞是否具有免疫调节功能。根据以上研究内容,本论文分为两部分。第一部分通过在有或无外源性转化生长因子β1(TGF-β1)的情况下,检测抗TCR selleck化学药品 Vδ1单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)扩增的、人PBMCs来源的V81T细胞内Foxp3的表达情况。结果显示,即使无外源性TGF-β1,抗TCR Vδ1mAb亦可扩增获得大量Foxp3+V81T细胞,且Foxp3分子在V81T细胞中稳定表达。应用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent

assay, ELISA)检测抗TCR Vδ1mAb扩增的PBMCs上清中是否存在TGF-β1。结果显示,培养上清中存在较高水平的TGF-β1。应用流式细胞技术(Fluorescence-activated cell sorting, FACS)检测发现V81T细胞是TGF-β1的主要来源细胞,且V81T细胞表达较高水平的TGF-β1受体(CD105)。接下来我们检测了Foxp3+Vδ1T细胞所表达的其它Treg细胞相关的表面标志物和细胞因子。结果显示,V81T细胞可表达GITR、CTLA-4、CD25等Treg细胞常见的表面分子和白介素-10(interleukin-10, IL-10)、TGF-β1。最后我们应用CFSE方法检测发现, CD25high V51T细胞对CD4+T细胞的增殖具有显著的抑制作用。以上研究结果提示,Foxp3+Vδ1T细胞是一种Treg细胞。这为某些肠上皮的炎症性疾病的发病和治疗、移植免疫免疫耐受机制的研究奠定了基础。 本论文的第二部分通过分离获得C57BL/6J小鼠的iIELs,经TGF-β1和γδTCR抗体(antibody, Ab)共同作用后,应用流式细胞技术检测γδ OSI-744 T细胞内Foxp3分子的表达情况。结果显示,TGF-β1和γδ TCR抗体可以共同诱导Foxp3+γδ T细胞的产生。同时,我们应用CFSE染色的方法检测发现,Foxp3+γδ T细胞对CD4+T细胞的增殖具有显著的抑制作用。以上结果表明,TGF-β1和γδ TCR抗体在体外能够共同诱导小鼠的iIELs产生Foxp3+γδ T细胞,并且该细胞具有免疫调节功能。这为阐明TGF-β1在小肠上皮免疫调节性γδ T细胞产生中的作用,以及某些小肠自身免疫性疾病的发病机制和治疗提供了线索。
尽管心血管疾病的治疗方法现已取得了很大的进展,但是各种心脏疾病导致的心力衰竭在全球仍然具有很高的发病率和死亡率。心力衰竭是一种由多因素引起的疾病,内在的分子机制还不是很清楚,但很可能与潜在的基因和蛋白质表达改变有关。本研究室前期通过对终末期心力衰竭患者心肌组织的基因组学筛选发现转化生长因子结合蛋白2(Latent TGF-β binding protein2, LTBP-2)表达显著升高(7.

1%。GDC-0941作用后的EC9706细胞,GDC-0941各剂量组出现染色质聚集等典型的凋亡形态学改变。流式细胞仪检测显示：GDC-0941作用EC9706细胞后,引起EC9706线粒体膜电位的改变,导致细胞凋亡。且随GDC-0941剂量的增加EC9706细胞凋亡百分率逐渐增大。免疫印迹结果发现,与对照组相比,GDC-0941刺激EC9706细胞后,Bax蛋白表达减少,且随GDC-0941剂量的减少表达显著；而Bcl-2蛋白表达增多,且随GDC-0941剂量的增加表达显著增多。

什么 结论 (1) GDC-0941能显著抑制人食管癌EC9706细胞增殖,对细胞生长具有抑制作用。 (2) GDC-0941对人食管癌EC9706细胞增殖抑制及促凋亡的作用,呈现一定的剂量依赖方式。 (3) GDC-0941对人食管癌EC9706细胞的凋亡作用机制,可能与上调Bax蛋白、下调Bc1-2蛋白的表达相关。
自2010年以来,肺癌的靶向治疗取得了很大进展,出现了许多针对EGFR, MET, HER2, VEGF和ALK等靶点的小分子药物,尤其是针对EGFR的靶向药物在临床上显示了很好的疗效。但是仍有一部分患者耐药,难以从EGFR的靶向治疗中获益。这部分患者,细查原因,大部分是因为肿瘤细胞中存在KRAS突变[2],但往往还有其他基因女(?)PIK3CA和PTEN等基因的突变[3-5]。这些耐药的患者的治疗也成为了临床上的难点,本课题即致力于这一方面的研究。 自80年代在人类肿瘤中检出突变KRAS以来,因其与人类肿瘤的密切关系而备受关注,关于它的文献数以万计。大部分以临床肿瘤标本为研究对象,也有以多种KRAS突变肿瘤细胞系为基础进行研究的。为探讨KRAS突变患者能否从小分子靶向治疗药物中获益,我们选用KRAS突变肺癌的肿瘤细胞模型进行实验。为了明确细胞资源中心所保藏的肿瘤细胞系中KRAS及相关的BRAF,

EGFR, PIK3CA基因的突变情况,我们使用高分辨率溶解曲线技术(HRM)对库藏人类肿瘤细胞系进行突变的检测。 或者 首先,我们提取了173种肿瘤细胞的总DNA,根据以往文献报导KRAS、 PIK3CA、BRAF(?)(?)EGFR基因突变的热点所在的6个DNA片段,进行PCR扩增,获得高拷贝数的目标序列。然后进行高分辨率熔解。在时间和荧光的曲线上区分出野生型,突变杂合型和突变纯合型的细胞系。筛查结果显示在肿瘤细胞系中KRAS突变在所筛查的4个基因中最为常见,其中胰腺癌细胞系突变率为66.67%,结直肠癌细胞系为52.94%,肺癌细胞系为21.25%,是突变率最高的三种肿瘤细胞系,与文献报道的临床肿瘤患者中KRAS的突变频率相当：胰腺癌>80%,结直肠癌≈50%,肺癌10-30%[6] PIK3CA、BRAF、EGFR基因的突变在肿瘤细胞系中突变频率分别为14.45%、6.35%和4.62%。另外,我们还检测到了COC1、A875、SF767、TE671及PANC-1细胞系中的一些未见报导的基因突变情况。 筛查结果明确了KRAS及相关基因在人类肿瘤细胞系中的突变情况,为开展肿瘤的靶向治疗研究提供了很好的模型。同时证明HRM技术是一种低成本,灵敏,特异和高通量的实验手段。 根据前述突变检测结果,选择我们KRAS单突变的A549和KRAS/PTEN双突变的NCI-H157两株NSCLC细胞,观察两种信号通路抑制剂GDC-0941(PI3K/AKT/mTOR通路,PI3K抑制剂)和AZD6244(KRAS/RAF/MEK通路,MEK抑制剂)对不同突变的NSCLC细胞的用药效果。分别用不同浓度的GDC-0941和AZD6244单独或联合作用,MTT法初步观察对细胞增殖的影响。根据观察结果确定联合给药的浓度。设立无药对照组、P13K单独抑制组(GDC-0941,0.5/5.0μu

mol/L)、联合Ⅰ组(0.5μ mol/L AZD6244+0.5μ 和 mol/L GDC-0941)及联合Ⅱ组(5.0μ mol/L AZD6244+5.0μ mol/L GDC-0941)。细胞经过不同组合浓度的抑制剂作用后,MTT法绘制增殖抑制曲线；平板集落形成法检测集落形成能力的改变；流式细胞仪检测细胞凋亡率及周期分布；Western blot检测不同组中抑制剂靶点下游周期及凋亡相关蛋白表达的差异。 在两株NSCLC细胞中,单独抑制RAS/RAF/MEK通路或PI3K/AKT/mTOR通路效果较差。抑制剂AZD6244或GDC-0941作用于A549细胞的抑制率分别可达25.5%和38.1%,作用于NCI-H157细胞的抑制率分别可达16.9%和35.1%。Westernblot结果显示AZD6244抑制RAS/RAF/MEK通路后(降低pERK活化)激活PI3K/AKT/mTOR通路(增强pAKT活化)。相反,GDC-0941抑制PI3K/AKT/mTOR通路后激活了RAS/RAF/MEK通路。结果表明单通路突变的细胞,仅抑制该突变通路,效果差。未突变通路的抑制剂对肺癌细胞的增殖也有抑制作用。无论肺癌细胞是KRAS单突变,还是KRAS/PTEN双突变,单通路抑制效果较差,需要双通路联合抑制提高疗效。 RAS/RAF/MEK和PI3K/AKT/mTOR双通路联合抑制可增强KRAS/PTEN双突变的NSCLC细胞的生长抑制作用。在NCI-H157细胞中,低剂量的联合Ⅰ组表现为两药协同作用(q值=1.22),高剂量的联合Ⅱ组表现为两药相加作用(q值=0.

89±16.83)/mm2(P
目的:探讨MMP-2、VEGF、CD105、Ki67在小细胞肺癌组织和正常肺组织中的表达情况以及之间的关系,分析其表达与小细胞肺癌生物学行为和预后的关系,为SCLC的临床治疗及预后判断提供理论基础。 方法:收集2004年1月至2009年12月在大连医科大学附属第一医院病理科存档石蜡组织标本且临床资料完整的小细胞肺癌患者42例及肺良性病变旁正常肺组织8例。小细胞肺癌患者中男性35例,女性7例,中位年龄64岁(43～79岁)。采用免疫组化S-P法测定所有病理标本中MMP-2、VEGF、CD105、Ki67的表达情况,并对所有病例进行随访。应用SPSS17.0统计软件进行数据分析,以P0.05)。3、MMP-2、VEGF、CD105表达均与SCLC患者肿块直径、淋巴结转移、远处转移和临床分期有关(P<0.05或P<0.01)。Ki67表达仅与SCLC患者的淋巴结转移有关(P0.05)。4、MMP-2、VEGF的表达均与CD105和Ki67表达显著相关(P<0.05或P<0.01)。5、MMP-2和VEGF的表达呈正相关(P<0.05或P
背景

肺癌的发病率及死亡率均居恶性肿瘤的首位,非小细胞肺癌(NSCLC)约占80%左右。含铂类药物的两联方案是标准的治疗方案,但其有效率仅有20%-35%左右。随着对肺癌分子生物学研究的深入,人们认识到不同的肿瘤有不同的驱动基因和蛋白表达,为肿瘤的分子靶向治疗奠定了基础。 目的 检测甲状腺转录因子-1(TTF-1)、Ki-67在非小细胞肺癌组织中的表达,探讨其临床意义,以期为非小细胞肺癌患者的诊断、治疗和预后评估提供有价值的分子生物学指标。 方法 将郑州大学第二附属医院2007年1月至2010年12月经病理检查确诊的原发性肺非小细胞癌134例患者作为研究对象,采集病例相关的临床病理资料,免疫组织化学法检测的TTF-1、Ki-67表达,采用SPSS17.0统计软件包进行数据分析。 结果 1.肺腺癌组织中TTF-1蛋白表达高达80.9%(55/68),而鳞癌组织中其表达率仅为7.0%(53/57),两者之间存在显著性差异(P=0.001)；Ki-67蛋白表达在肺鳞癌、肺腺癌、肺腺鳞癌无显著性差异(P=0.063)。 有 2.TTF-1蛋白表达率在女性、细胞分化好、较小的肿瘤(最大径≤3cm)及I期、II期患者中较高(P<0.05)；Ki-67蛋白在有吸烟史、细胞分化差及有淋巴结转移的患者中有较高表达(P<0.01)；Ki-67蛋白表达的影响因素为细胞分化程度和淋巴结转移情况(P
肾细胞癌(renal

cell carcinoma, RCC)起源于肾实质肾小管上皮细胞,其发病率高,大约90%的肾脏恶性肿瘤为RCC。随着人们生活方式和生活环境的改变,肾癌的发病率不断增加。据世界癌症中心资料显示,2015年美国预测新发的肾癌患者人数为61,560,肿瘤特异性死亡患者数目也高达14,080。我国肾癌的患病人数也逐年增加,少于膀胱癌成为泌尿男生殖系第二位肿瘤。对于晚期转移性RCC患者来说,免疫治疗和靶向药物治疗已成为各大指南推荐的治疗策略。尤其随着分子遗传学的发展,越来越多的分子信号通路被发现在RCC中行使着重要的功能。在此基础上,美国、欧洲以及中国批准了越来越多的靶向药物用于治疗晚期转移性RCC。然而,随着分子靶向药物的应用,靶向药物的耐药性问题严重影响了RCC治疗的疗效。因此寻找RCC发生发生进展中新的靶点以及信号通路,预测RCC患者的预后,指导靶向药物的选择以及寻求靶向药物耐药后的解决方案已成为晚期转移性RCC研究中亟待解决的问题。Cullins进化上高度同源,参与构成了最大的E3泛素连接酶,参与调控细胞周期、转录、信号转导和发育等重要的生物进程。人类基因编码8种Cullin成员,包括CUL1、CUL2、CUL3、CUL4A、CUL4B、CUL5、CUL7和PARC。CUL4B在细胞增值、DNA复制及细胞周期调控等方面行使相应功能。X染色体上CUL4B发生突变可以造成精神发育迟滞。敲除CUL4B的小鼠在胚胎阶段发生死亡。除此以外,CUL4B具有定位于细胞核的信号,在细胞核里面行使相关功能。研究证实CUL4B能够抑制miR-372和miR-373,上调CDK2的表达,从而促进DNA的复制。此外,CUL4B能够下调抑癌基因p16、PTEN等的功能,促进肿瘤的发生。因此,最近一段时间许多研究都发现了CUL4B在恶性肿瘤中行使相应的功能。研究发现CUL4B与肝癌、结直肠癌、胶质瘤、骨肉瘤以及肿瘤微环境等密切相关。但是,CUL4B在泌尿系统的肿瘤尤其是RCC中的作用及机制尚未有文献报道。c-Met是酪氨酸激酶受体(receptor MDV3100 tyrosine kinase, RTK),与其特异性配体肝细胞生长因子(hepatocyte

Bioactive Compound Library数据表 growth factor, HGF)相结合后,发生同源二聚化和磷酸化,从而发挥相应的作用。c-Met与HGF结合后激活一系列通路,包括Ras/Raf/MEK/ERK通路、PI3K/Akt通路以及黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)通路等。HGF/MET是调控血管生成、细胞增殖、细胞周期以及细胞侵袭转移等的重要信号通路。尽管c-Met在正常生理条件下对于维持组织稳态非常重要,但是c-Met突变、扩增以及过表达等变化,造成其在人类肿瘤中异常激活。研究发现c-Met在肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)和乳头状肾细胞癌(papillary renal cell carcinoma, pRCC)中均过表达。c-Met的表达水平与RCC的病理特性以及疾病的预后转归关系密切。因此c-Met抑制剂如卡博替尼等作为RCC治疗中的靶向药物也纷纷进入临床试验阶段。近期研究表明c-Met激活与恶性肿瘤分子靶向药物治疗中的耐药问题关系密切。因此,c-Met在RCC发生发展及靶向药物耐药等方面具有重要研究价值,但是CUL4B对c-Met通路是否有调控作用,目前尚未有文献报道。基于以上研究背景,我展开了下面的研究：首先,探讨CUL4B在RCC中的表达及作用；然后,寻找CUL4B在RCC中的作用机制,通过蛋白芯片发现c-Met可能在CUL4B的调控中发挥重要作用；最后进一步探讨CUL4B调控c-Met通路对RCC的影响。通过本课题的研究以期发现RCC发生进展中新的靶点和分子信号通路,从而更好地预测RCC患者的预后、指导靶向药物的选择以及寻求靶向药物耐药后的解决方案。第一部分CUL4B在肾细胞癌中的表达及作用已知CUL4B在多种肿瘤中发挥重要作用,且表达量都升高,为进一步探讨CUL4B在RCC中是否同样具有促进肿瘤发生进展的作用,本部分利用了人肾细胞癌细胞系、人肾癌组织标本以及裸鼠成瘤动物模型等实验对象,展开相应研究。具体情况如下：1.

01)；与细胞模型组相比，雷公藤含药血清组、穿山龙总皂苷含药血清组的NF-κB p65DNA结合活性均显著降低(P＜0.01)，且两组之间比较无显著性差异(P＞0.05)。 2各组滑膜细胞STAT3蛋白的表达 STAT3蛋白在细胞模型组的表达与空白对照组相比显著增多(P＜0.01)；与细胞模型组相比，雷公藤含药血清组、穿山龙总皂苷含药血清组STAT3蛋白的表达显著减少(P＜0.01)，且两组之间比较无统计学意义(P＞0.05)。

3各组滑膜细胞核蛋白提取物AP-1的DNA结合活性 与空白对照组比较，细胞模型组滑膜细胞核蛋白提取物AP-1的DNA结合活性显著增高(P＜0.01)；与细胞模型组相比，雷公藤含药血清组、穿山龙总皂苷含药血清组AP-1的DNA结合活性降低(P＜0.05)，且两组之间比较无显著性差异(P＞0.05)。 结论： 本研究应用IL-17和TNF-α联合诱导的大鼠滑膜细胞株RSC-364细胞模型首次在体外证实了穿山龙总皂苷含药血清可以抑制NF-κB p65、AP-1的DNA结合活性及STAT3蛋白的表达，考虑穿山龙总皂苷通过上述信号转导途径来调控血管新生关键因子VEGF的产生，进而抑制RA血管新生。
本研究运用细胞培养、激光共聚焦、透射电镜、Western blotting等细胞分子生物学技术,研究了镉诱发神经细胞凋亡过程中,自噬通路参与机制,初步探讨加入3-MA和/或雷帕霉素对镉诱导自噬的影响以及与镉激活mTOR通路诱发神经细胞凋亡的关系,并观察了镉诱发神经细胞自噬与Akt/mTOR通路激活和胞内Ca2+([Ca2+]i)升高的关系。具体结果如下：

C59化学结构 Sorafenib小白鼠 1镉诱导神经细胞自噬与mTOR通路激活的关系及其在细胞凋亡中的作用 PC12细胞悬液接种于6孔培养板中,以不同浓度镉(0、2.5、5、10和20μM)和0.1%血清饥饿处理神经细胞12h,或用20μM镉处理神经细胞为0-24h,或用3-MA和/或雷帕霉素(Rap)预处理神经细胞后暴露镉(10和20μM)12h。采用透射电镜、激光共聚焦法、形态学观察等方法分析镉诱发的神经细胞自噬表现及其凋亡的关系；Western blot分析Akt/mTOR通路和LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白变化。结果显示,10和20μM镉处理PC12细胞12h诱导自噬体发生；镉激活自噬关联神经细胞凋亡,这被镉以浓度和时间依赖的方式诱发神经细胞LC3-Ⅱ增加,以及3-MA预处理部分地抑制镉诱导的LC3-Ⅱ表达和营救神经细胞凋亡证据支持；镉激活自噬和激活mTOR通路可能为相伴并行共同参与神经细胞凋亡。提示：镉诱导神经细胞自噬与mTOR通路激活相伴并行在神经细胞凋亡中发挥作用。 2钙离子在镉诱导神经细胞自噬和mTOR通路激活中作用及机理 PCl2细胞悬液接种于6孔培养板在37℃,含5%CO2培养箱培养。第2天,用20μM BAPTA/AM、100μM EGTA、100μM2-APB或10μMKN93预处理1h后暴露镉(10和20μM)12h。Western blot分析LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白变化和Akt、S6K1、4E-BP1蛋白磷酸化表现。我们发现,BAPTA/AM、EGTA和2-APB抑制镉诱导神经细胞LC3-Ⅱ表达和Akt和mTOR介导的S6K1和4E-BP1蛋白磷酸化增加,表明镉诱导胞内钙离子升高与胞外Ca2+内流和内质网Ca2+释放有关关联神经细胞自噬和Akt/mTO通路激活。我们注意到,KN93明显抑制镉诱导的LC3-Ⅱ增加,且Akt和mTOR介导的S6K1和4E-BP1蛋白磷酸化被KN93明显抑制,说明镉可能通过[Ca2+]i升高引起CaMKⅡ激活关联神经细胞自噬和：nTOR通路激活。提示：钙离子信号转导在镉诱导神经细胞自噬和mTOR通路激活中有重要作用。
目的：响尾蛇毒素（crotoxin，简称CrTX）是南美响尾蛇Crotalus Capmatinib 花费 durissusterrificus毒液的主要毒素，包括一个弱毒性的碱性成分PLA2（CB）和一个无酶活性无毒性的酸性成分（crotapotin，CA），它是一个异二聚体的β-神经毒素。CrTX经典的生物活性包括神经毒性、肌肉毒性、肾毒性和心脏毒性等，近年大量研究说明它还具有免疫调节、抗炎、抗微生物、镇痛和抗肿瘤等多种作用。多篇文献报道CrTX体内外都具有抗肿瘤活性，但是其分子机制尚未完全阐明。本文以SK-MES-1肺癌细胞为模型，从体外细胞和分子水平研究了CrTX的抗肿瘤作用及其机制。

方法：首先采用MTT法检测CrTX对SK-MES-1肺癌细胞的细胞毒作用，并采用平板克隆法检测CrTX对SK-MES-1细胞克隆形成能力的影响；采用流式细胞术检测CrTX对细胞周期的影响，Western blot检测PCNA蛋白水平的变化；采用Hoechst33258染色从细胞核形态观察细胞凋亡、Annexin V-FITC/PI双染定量凋亡率，并用Western blot检测Caspase-3蛋白的活性；采用Western blot检测自噬相关蛋白LC3、p62和Beclin1的变化；Western blot检测CrTX给药后P-p38和p38蛋白水平的变化，引入p38MAPK特异性阻断剂SB203580（简称SB），用MTT法检测阻断p38MAPK通路对细胞生存率的影响；采用SB阻断p38MAPK通路，观察对CrTX诱导的细胞周期阻滞、凋亡以及自噬的影响。 结果：CrTX显著抑制SK-MES-1肺癌细胞的生长，并呈现浓度和时间依赖性效应，72h的IC50为25.

1益气养阴活血方为导师临床经验用方,首次对其作用机制做相关实验研究。 1.2从ERK通路血流动力学和非血流动力学两方面效应探讨药物的作用机制。 2、临床研究 2.1观察中医药治疗DN的远期疗效(≥2年)。 2.2从多方面观察指标更全面地反映整体综合疗效。 2.3设定了不同的蛋白尿和肾功能终点事件作为次要结局指标,更早期反映疗效差异。
皮肤创伤愈合是一个复杂的生物学过程,它启动一系列复杂的生物学事件,包括炎症、组织新生及组织重构[1]。虽然许多研究采用不同的方法治疗皮肤创伤修复,但愈合质量低、附属器官不可再生等依然是皮肤创伤愈合过程中的关键问题。目前,皮肤移植是修复大面积皮肤损伤的最有效方法。其中,应用骨髓间充质干细胞(Bone Selleckchem BI6727 mesenchymal stem cells, BMSCs)治疗重症皮肤创伤展现出良好的应用前景。已有研究结果证实BMSCs在促进创面愈合方面起到积极的作用。Badiavas将骨髓间充质干细胞移植到深Ⅱ度烧伤创面,发现其明显促进创面的愈合[2]。付小兵等将BMSCs移植至猪深度烧伤创面,发现创面愈合速度明显加快,表皮增厚,真皮神经纤维增多,大大改善了创面愈合质量[3]。文献报道BMSCs还参与表皮、汗腺及创面血管的重建[4]。这些研究结果表明BMSCs是非常好的皮肤组织工程种子细胞。 创伤愈合的各个阶段都有生长因子的参与和调控,生长因子对治疗慢性难愈合皮肤创口和大面积烧伤创面有着广阔的应用前景[5]。活化素(Activin)是转化生长因子-β(transforming

growth factor β, TGF β)超家族成员,成熟组织内,Activin信号可调节伤口愈合和表皮再上皮化,在皮肤创伤愈合过程中具有重要的作用[6]。而且Activin和其拮抗剂卵泡抑素(Follistatin)共同调节毛囊的发育和周期循环[7]。课题组前期研究发现Activin B在In vitro水平上通过JNK/MAPK信号通路促进角朊细胞的迁移,从而加速创伤修复过程[8,9，10]；近期研究显示：在In vivo水平上,Actvin B通过RhoA-JNK-cJun信号通路调节伤口愈合,并且在毛囊的再生和毛囊细胞的增殖方面起着关键的调控作用[11]。

干细胞从定居的部位进入到相应的组织器官内才能实现该部位的再生和修复,而细胞迁移的过程是受趋化因子、趋化因子受体系统所调控的[12,13]。在创伤愈合的过程中,Activin/TGF-β是趋化因子之一,可以通过不同的方式作用于炎症及修复细胞,调节细胞的趋化性迁移、增殖分化和细胞外基质合成与分泌[14]。研究发现BMSCs表面高度表达Activin受体,而且Activin/TGF-β通路下游信号分子Smad3的缺失导致BMSCs迁移能力降低[15.16,17],提示Activin/TGF-β信号可能在调控BMSCs的生物学功能上发挥重要作用。因此鉴于BMSCs能加速创伤愈合并促进皮肤血管及汗腺等组织的再生,而Activin B能促进BMSCs的迁移,我们假设Activin CP868596 B可能改善了BMSCs介导的创伤修复,为了验证假设我们提出将Activin B和BMSCs联合起来,观察其治疗创伤愈合的作用,并在细胞水平上探索其可能的信号机制。本研究为临床治疗创伤修复提供了新的理论及实验依据。 (一)目的 探讨Activin B联合BMSCs对治疗大鼠皮肤创伤愈合的影响。 (二)方法 24只健康成年SPF级SD大鼠随机分为四个组：PBS对照组,BMSCs组,Activin B组和Activin B联合BMSCs组。10%水合氯醛(0.003ml/g)腹腔注射麻醉,SD大鼠背部两侧剪毛后用蜂蜜脱毛冻蜡脱毛,制作面积为1cm2正方形切口,深达皮下。术后动物自由进食、水。术后每天用细Mark笔将各组未愈合创面面积描记在透明薄膜上,利用数码相机在相同的条件下对描记下的图像拍照,IPP图像分析系统计算未愈合创面面积,计算创面愈合率,愈合率=(原始创面面积—未愈合的创面面积)/原始创面面积×100%。术后3d、7d、14d、21d取伤口周围0.5cm皮肤,PBS冲洗,4%多聚甲醛固定,PBS冲洗,乙醇逐级脱水,二甲苯透明,石蜡包埋。切片(5μm),二甲苯脱蜡,乙醇逐级复水,常规的苏木精伊红(hematoxylin and eosin, H&E)染色。 (三)结果 与Activin

B、BMSCs组及PBS组相比,ActivinB联合BMSCs组可以显著促进SD大鼠皮肤创面愈合,移植后第7d、14d,Activin B联合BMSCs组创面愈合率显著高于Activin B、BMSCs组及PBS组。移植后第12d,Activin B联合BMSCs处理组的12个创口(n=6)已完全闭合,而Activin 和 B、BMSCs组及PBS组伤口尚未完全闭合。Activin B组和BMSCs组于移植后14d创面完全愈合,而PBS组创面完全闭合发生于第16d。第14d H&E结果显示Activin B、BMSCs组及Activin B联合BMSCs处理组已经完成再上皮化,而且与PBS组和BMSCs组相比,Activin B组和Activin B联合BMSCs可以促进皮肤毛囊的再生,提示Activin B联合BMSCs不但可以促进急性创伤的愈合还可以促进伤口部位毛囊的再生。(四)结论 以上研究结果提示Activin B联合BMSCs能够促进大鼠皮肤创伤愈合。 (一)目的 在细胞(In vitro)水平及载体(In vivo)水平上探讨Activin B通过何种途径诱导BMSCs从而促进创伤愈合。 (二)方法 在细胞(In vitro)水平上利用免疫组化观察K15,K19的表达；利用细胞划痕实验、细胞趋化实验、细胞的Actin结构观察实验记录细胞迁移情况；在载体(In vivo)水平上利用Brdu标记观察创伤愈合过程中细胞增殖的变化。 (三)结果 1.K15,K19的表达：24孔板中放入coverglass,第4代BMSCs接种其中,每孔细胞含量约1×104个,分别用含5%胎牛血清的DMEM(PBS组)和5%胎牛血清+10ng/mlActivin B的DMEM (Activin B组)培养。从培养第一天起开始直到第21d,隔天一次,取出coverglass,进行细胞免疫化学检测。结果显示：PBS组和Activin B组相比,K15,K19的表达均未见显著性差异。 2.

015),且与患者的性别、年龄、瘤体直径、吸烟史、高血压史、血脂异常无明显相关(P>0.05)。 结论：PI3K在腹主动脉瘤中高表达,可能在疾病的发生中发挥重要作用,其具体作用机制仍需进一步实验研究阐明。
慢性粒细胞白血病（Chronic Sorafenib研究购买 Myeloid Leukemia，CML）是一种起源于白血病干细胞（leukemia stem cells，LSCs)的恶性增殖性疾病，迄今没有有效的根治办法。目前国内外的研究普遍认为LSC是正常造血干细胞（hematopoietic

stem cell，HSCs）经BCR-ABL癌基因转化而来。由于BCR-ABL基因编码的BCR-ABL融合蛋白具有持续活化的酪氨酸激酶活性，使得LSC具有比HSC更强的自我更新和增殖能力而大量扩增。LSCs也因此被认为是CML发病的根源，靶向BCR-ABL清除LSCs对于治愈CML具有重要的临床意义。格列卫（Imatinib Mesylate，IM）是以BCR-ABL蛋白为靶点治疗CML的分子靶向药物，能使绝大部分CML患者获得有效缓解，成为当前CML治疗的一线药物。然而，研究发现IM只能杀死增殖的成熟CML细胞而不能有效诱导LSCs凋亡。因此，IM不能彻底清除CML患者体内的LSCs而无法根治CML。LSCs对格列卫的凋亡抗性机制迄今不完全清楚。阐明LSCs的格列卫凋亡抗性机制对于以LSCs为靶点制定根治CML的策略具有重要意义。大量的研究表明，miR-21的异常表达与肿瘤细胞耐药密切相关miR-21抑制剂能有效增强化疗药物对肿瘤细胞的凋亡诱导作用。目前，miR-21在LSCs中的表达及其与LSCs的格列卫凋亡抗性的关系尚无研究报道，有待深入探讨。 本论文采用Real-time PCR技术检测IM处理后CML CD34+干/祖细胞以及Sup-b15细胞和CML细胞K562、Ku812的miR-21的表达水平变化，在此基础上，进一步通过miR-21激动剂及其抑制剂转染、流式细胞术等方法，研究miR-21在调控CMLCD34+干/祖细胞对IM的凋亡抗性中的作用及其分子机制。

研究目的 本论文通过研究miR-21在调控CD34+干/祖细胞对IM的凋亡抗性中的作用及其分子调控机制，探索增强IM清除LSCs的策略，为以LSCs为靶点根治CML提供参考资料和科学依据。 研究方法 1.探讨miR-21在调控CML CD34+干/祖细胞对IM凋亡抗性中的作用 1.1使用Ficoll利用密度梯度离心法把健康人和CML病人的骨髓样本进行分离，分别获得健康人和CML病人的骨髓单个核细胞（BMMC）；利用免疫磁珠分选系统（MACS）对健康人和CML病人的骨髓单个核细胞分别进行分选，获得健康人和CML病人CD34+干/祖细胞；流式细胞术鉴定CD34+干/祖细胞的分子表型及其纯度。 Capmatinib制造商 1.2Annexin V/PI双染法检测IM诱导的CML CD34+干/祖细胞凋亡；Real-time PCR检测IM处理后CML CD34+细胞的miR-21表达水平；Annexin

V/PI双染法检测转染antagomiR-21对IM诱导的CML CD34+细胞凋亡的影响。 1.3MTS方法检测IM对Sup-b15细胞增殖的影响；Annexin V/PI双染法检测IM诱导的Sup-b15细胞凋亡；Real-time PCR检测IM处理后Sup-b15细胞的miR-21表达水平；Annexin V/PI双染法检测Sup-b15细胞转染antagomiR-21后，IM诱导的细胞凋亡变化。 1.4MTS方法检测IM对CML细胞K562和Ku812的细胞增殖影响；Annexin selleck BTK inhibitor V/PI双染法检测IM诱导的CML细胞K562和Ku812的细胞凋亡；Real-time PCR检测IM处理后CML细胞K562和Ku812的miR-21表达水平；Annexin V/PI双染法检测K562和Ku812转染agomiR-21后，IM诱导的细胞凋亡变化。 2.探讨miR-21调控CML CD34+细胞对IM凋亡抗性的分子机制研究 2.1流式细胞术检测CML CD34+细胞和三种Ph+白血病细胞（K562、Ku812、Sup-b15）细胞经过IM处理后细胞内PTEN和PDCD4蛋白的表达水平变化；检测CD34+干/祖细胞转染antagomiR-21后PDCD4及磷酸化AKT蛋白的变化情况，评价抑制miR-21对PI3K/AKT信号通路的影响。 2.2Annexin V/PI双染法检测PI3K抑制剂（Wortmannin或LY294002）和IM联合作用于CML CD34+细胞和Sup-b15细胞后，CML CD34+细胞和Sup-b15细胞的细胞凋亡。 2.3流式细胞术检测PI3K抑制剂（Wortmannin或LY294002）和IM联合作用于CMLCD34+干/祖细胞和Sup-b15细胞后细胞内磷酸化AKT蛋白的变化情况。 实验结果 1.探讨miR-21在调控CML CD34+干/祖细胞对IM凋亡抗性中的作用 1.1流式细胞术检测结果显示，免疫磁珠分选系统纯化的CD34+干/祖细胞的纯度为89.23%。 1.2细胞凋亡结果显示CML CD34+干/祖细胞对IM不敏感；经过IM处理后miR-21表达水平有一定的上调；转染antagomiR-21能显著增加IM诱导的CML CD34+干/祖细胞凋亡，细胞凋亡率由对照组的3.983±0.2973增加至9.437±0.5601。 1.

01M磷酸盐缓冲液(PBS, selleck chemicals NaCl137mmol/L, KCl2.7mmol/L, Na2HPO44.3mmol/L, KH2PO41.4mmol/L, pH7.2～7.4)漂洗三次,每次3min;加入5%的BSA封闭1h。一抗anti-NR1antibody小鼠抗大鼠(millipore, USA1:250PBS稀释),第二个一抗anti-TNFR1/2antibody (Abcam,1:250PBS稀释)兔抗大鼠,孵育,室温过夜。漂洗3次,室温下闭光孵育AlexFluo488标记驴抗小鼠IgG (Invitrogen, USA), AlexFluo594标记驴抗兔IgG(Invitrogen, USA,1:1000PBS稀释)2h。漂洗3次。贴片,封片后用Olympus正置荧光显微镜进行观察并拍照。 研究内容 一共分为两部分 第一部分：形态学检测 1.将标有绿色荧光蛋白的病毒注入腰膨大显微镜下可见绿色荧光,说明病毒确实注入了细胞内。 2.显微镜下免疫荧光结果显示TNFR1或TNFR2与NMDA受体共定位。 第二部分：行为学和Western blot检测。 1.鞘内注射空载病毒对照组

将空载病毒(GFP)注射入大鼠的腰膨大,足底分别注射CFA或生理盐水。结果： 行为学的结果显示组,与组相比较,成年雄性大鼠的左侧足底皮肤下注射炎性致痛物质CFA后进行关于热痛行为的缩爪反应观察,PWL在脚掌注射后的第1d,3d,7d较对照组减少(P组相比,组,大鼠腰膨大处给予TNFR1-siRNA后,动物脚掌注射CFA后进行热痛行为观察,PWL在脚掌注射后第1d,3d,7d均明显延长(P组,鞘内给予TNFR1-siRNA后,脊髓背角TNFR1和p-NR1的表达减少。 3.鞘内注射TNFR2-siRNA组 将载有TNFR2-siRNA的腺病毒注射入大鼠的腰膨大,足底注射CFA或生理盐水。 结果： 行为学结果分析,与对照组相比,组大鼠给予TNFR2-siRNA后,脚掌射CFA引起的PWL在第1天明显延长(p组,鞘内给予能抑制TNFR2-siRNA,脊髓背角神经元TNFR2和p-NR1的表达减少。 4.鞘内注射TNFR1&/2-siRNA组 将载有TNFR1&2-siRNA注射入大鼠的腰膨大,足底分别注射CFA或生理盐水。 行为学结果显示：组,与组大鼠的PWL在第1d,3d,7d未呈现显著性差异；而与相比,组的PWL值在在第3d,7d呈现显著差异(p
目的通过观察不同时间段肺组织中小窝蛋白-1(caveolin-1,

cav-1)、p-P38MAPK和IL-8的表达水平,探讨cav-1在机械通气所致肺损伤(VILI)发生中的作用。方法雄性Wistar大鼠24只,随机分为3组：对照组、大潮气量通气半小时组(H-VT0.5h组)和大潮气量通气2小时组(H-VT2h组)。在光镜下观察各组大鼠肺组织病理学改变,测定BALF总蛋白含量和肺湿/干重比值(W/D),采用免疫组织化学染色法测定肺组织cav-1、p-P38MAPK和IL-8的蛋白表达水平,并进行相关性分析。 结果 1.肺组织cav-1表达结果：H-VT0.5h组(0.142±0.014)和H-VT2h组(0.267+0.017)cav-1蛋白表达均明显高于对照组(0.118±0.010)(均P<0.01),H-VT2h组cav-1蛋白表达明显高于H-VT0.5h组(P0.05)。 因为 3.肺组织P-P38MAPK表达结果：H-VT2h组(0.514±0.031)p-P38MAPK蛋白表达明显高于对照组(0.148±0.016)和H-VT0.5h组(0.166+0.010)(均P0.05)。

4.肺组织cav-1、p-P38MAPK、IL-8相关性分析结果：各组大鼠肺组织中cav-1蛋白表达与p-P38MAPK之间呈正相关(r=0.787,P0.05)。 6.BALF总蛋白含量测定结果：H-VT2h组(0.620±0.140)BALF中总蛋白含量明显高于对照组(0.220±0.063)和H-VT0.5h组(0.300±0.140)(均P0.05)。 并且 7.肺组织病理学结果：随着机械通气时间延长,大鼠肺组织损伤程度呈逐渐加重趋势。结论 1.大潮气量机械通气诱导了cav-1的表达,早期(0.5h内)以保护作用为主,后期(2h后)以损伤作用为主。 2.cav-1通过激活P38MAPK信号通路,使IL-8等炎症因子表达增多,可能是导致VILI发生的重要途径之一。
目的： 1、建立新生鼠窒息模型，观察窒息后新生鼠血清心肌酶（CK、LDH）变化、心肌组织损伤及心肌细胞凋亡情况。 2、探讨窒息新生鼠缺氧缺血性心肌损伤过程存在AMPK信号通路的激活。 3、研究脂联素对窒息新生鼠缺氧缺血性心肌损伤的作用与心肌组织AMPK表达的影响，并探讨其可能的机制。 方法： 1、实验分组：50只7日龄新生SD大鼠按完全随机法随机分成5组（每组10只）：假手术组、窒息组、APN组、Compound C组、APN+Compound C组。 2、新生鼠常压窒息模型制备及药物干预：仅假手术组模拟常压窒息过程，不塞瓶及复氧，其余四组制备常压窒息模型，APN组及APN+Compound C组在窒息前半小时给予腹腔注射APN120μg/kg,Compound C组与APN+Compound C组在窒息前1小时给予腹腔注射Compound C20mg/kg,假手术组及窒息组分别接受同剂量的生理盐水。每组分别在复氧2小时后立即取血及心脏组织。 3、观察指标：检测血清心肌酶CK、LDH水平；HE染色观察心肌病理形态学改变；免疫组织化学染色法检测心肌组织AMPK蛋白表达含量；TUNEL法定性及定量分析心肌细胞凋亡。 4、数据分析：采用SPSS19.0统计软件进行统计分析，实验数据以均数标准差（x s）表示，采用单因素方差分析（one-wayANOVA），并进行方差齐性检验，两两比较用SNK-q检验，P＜0.05表示有统计学意义，P＜0.01表示有显著性差异。 结果： 1、各组血清心肌酶CK、LDH值比较：与假手术组相比，窒息组CK、LDH值显著升高（P＜0.01）；与窒息组相比，APN组心肌酶CK、LDH水平明显下降（P＜0.01），而Compound C组及APN+Compound C组CK、LDH值明显升高（P＜0.01）；但APN+Compound C组CK、LDH水平低于Compound C组，且差异显著（P＜0.