12±0.72,SP600125+LPS组为0.66±0.36,对照组为0.59±0.30。SP600125+LPS组与对照组Z值均小于LPS组(P<0.05或P0.05)。 4.3Western blot检测JNK、P-JNK蛋白 Western blot曝光灰度扫描结果(Z值)显示,LPS组为1.26±0.09,SP600125+LPS组为0.49±0.18,对照组为0.95±0.21。SP600125+LPS组Z值均小于其它2组(P<0.05或P<0.05),LPS组Z值显著大于对照组(P
目的：特发性肺纤维化是以间充质细胞增生和细胞外基质异常沉积为特点的渐进性疾病，正常肺组织主要由肺泡上皮细胞组成，肺泡上皮细胞分Ⅰ型和Ⅱ型。肺泡Ⅱ型上皮细胞有干细胞特性，可在细胞因子TGF-β1的作用下转分化为间质细胞（EMT），表达间质细胞表型标志物肌动蛋白（ACTA2）和V-波形蛋白(Vim)，从而加快肺纤维化进程，其可能机制为活化TGF-β1底物Smad、P38MAPK。青蒿琥酯为传统的抗疟疾药，前期研究证实其有抗纤维化作用。本研究拟用青蒿琥酯为工具药，探讨在青蒿琥酯作用下对TGF-β1诱导的EMT过程的影响及其可能机制，从而研究青蒿琥酯与肺纤维化的关系。 方法：实验分两部分。第一部分研究青蒿琥酯对TGF-β1诱导的肺泡上皮-间质细胞转分化过程中TGF-β1/smad通路影响的剂量效应及时间效应：体外培养大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（RLE-6TN）；预实验检测TGF-β1诱导浓度；MTT法检测青蒿琥酯作用于TGF-β1诱导的RLE-6TN细胞12小时、24小时、48小时后的半抑制浓度（half

maximal inhibitory concentration，IC50），根据IC50选择青蒿琥酯干预浓度；细胞分6组（剂量效应），①空白组；②TGF-β1（3ng/ml）组；③TGF-β1（3ng/ml）联合青蒿琥酯(1ug/ml)组；④TGF-β1（3ng/ml）联合青蒿琥酯(2ug/ml)组；⑤TGF-β1（3ng/ml）联合青蒿琥酯(4ug/ml)组；⑥TGF-β1（3ng/ml）联合青蒿琥酯(8ug/ml)组，培养24小时后，在倒置显微镜下观察细胞形态；收集细胞，提取总RNA，RT-PCR法检测各组Smad3、Smad7、ACTA2、Vim的mRNA表达情况；提取总蛋白，Western 不 已经 bloting法检测各组P-Smad3、Smad7、ACTA2、Vim蛋白表达情况；细胞分成4组（时间效应），①空白组（1%FBS）；②TGF-β组（3ng/ml）；③TGF-β（3ng/ml）联合青蒿琥酯（1ug/ml）组；④青蒿琥酯组（1ug/ml），培养12、24、48小时后；收集细胞，提取总RNA，

RT-PCR法检测各组Smad3、Smad7、ACTA2、Vim的mRNA表达情况；培养24小时后，提取总蛋白，Western bloting法检测各组P-Smad3、Smad7、ACTA2、Vim蛋白表达情况。 第二部分研究不同剂量的青蒿琥酯对TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞-间质细胞转分化过程中TGF-β1/P38MAPK通路的影响：体外培养大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（RLE-6TN）；细胞分6组，①空白组；②TGF-β1（3ng/ml）组；③TGF-β1（3ng/ml）联合青蒿琥酯(1ug/ml)组；④TGF-β1（3ng/ml）联合青蒿琥酯(2ug/ml)组；⑤TGF-β1（3ng/ml）联合青蒿琥酯(4ug/ml)组；⑥TGF-β1（3ng/ml）联合青蒿琥酯(8ug/ml)组，培养24小时后，收集细胞，提取总RNA，RT-PCR法检测各组P38MAPK、ACTA2、Vim

mRNA表达情况；提取总蛋白，Western bloting法检测各组P38MAPK、ACTA2、Vim蛋白表达情况。 结果：第一部分：青蒿琥酯作用于TGF-β1诱导的RLE-6TN细胞12小时后无抑制作用，24小时后的IC50为8.86ug/ml，48小时IC50为5.04ug/ml；镜下观察结果示与正常组相比，TGF-β1组RLE-6TN细胞由铺路石状上皮形态变成梭形、纺锤形，而且其细胞间隙略变大，青蒿琥酯作用于TGF-β1诱导的RLE-6TN细胞24小时后，与TGF-β1组比较，细胞的梭形结构减少，部分恢复铺路石状上皮形态，但细胞之间连接仍松散，其中TGF-β1联合青蒿琥酯1ug/ml组表现最明显；RT-PCR及Western bloting结果示与空白组比较，TGF-β1组Smad3、Smad7、ACTA2、Vim mRNA及蛋白均表达增加（P<0.05）；与TGF-β1组比较，TGF-β1联合青蒿琥酯组Smad7mRNA及蛋白均表达增加（P<0.05）；Smad3、ACTA2、VimmRNA表达降低（P<0.05），P-Smad3、ACTA2、Vim蛋白表达降低（P
一、研究背景 因为 气道平滑肌细胞(Airway smooth muscle cell, ASMC)异常过度增殖是支气管哮喘(哮喘)气道重塑的重要特征。自1922年首次在尸检中发现哮喘致死患者的气道平滑肌层显著增厚,接下来的众多研究也证实了各阶段哮喘患者均存在不同程度的气道平滑肌容量增加。增厚的气道平滑肌收缩能力增强,且对变应原的反应性增加；同时平滑肌层增厚导致气道管径变窄,气流受限程度加剧。气道平滑肌过度增殖与哮喘严重程度相关,是导致气流受限向不可逆发展的关键环节。目前治疗哮喘的瓶颈在于,虽然糖皮质激素、支气管舒张剂能够很好地控制和缓解哮喘发作,但无法阻止和逆转不可逆气流受限的发展。抑制气道平滑肌增殖可能成为治疗哮喘的新靶点,因此,研究ASMC增殖的机制十分必要。在哮喘的炎性气道环境中,多种因素可引起ASMC增殖增加,主要有：生长因子、细胞因子、炎症介质、以及多种酶类。这些有丝分裂原作用于细胞膜上的相应受体,引起下游一系列信号通路的激活,其中研究的最多的是细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)通路。细胞外信号经传导、放大、整合后入核,导致转录因子释放,细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)表达,推动细胞进入有丝分裂周期而完成增殖过程。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是肾素-血管紧张素系统(RAS)的重要成员,以往认为其主要作用是调节血压及体液平衡。近年来的大量研究证实,AngⅡ还与细胞增殖、凋亡、迁移、分化、炎症反应及免疫调节等多种生物学行为有关。有研究表明,哮喘发作时伴有肺脏局部RAS的活化,血浆AngⅡ水平升高。AngⅡ与ASMC增殖是否存在关联,目前的研究结果并不明确,且其机制尚未充分阐明。本研究将Ang Ⅱ、Ang Ⅱ受体拮抗剂Losartan、ERK激酶抑制剂PD98059分别或同时作用于原代培养的人ASMC,从活细胞酶水平、细胞周期两个层面检测细胞增殖情况,检测Cycling D1mRNA及蛋白表达水平,并检测ERK磷酸化水平,旨在探讨AngⅡ对ASMC增殖的影响并初步探讨其作用机制。 二、研究目的 1.