1动物模型 120只10周龄的雄性Wistar大鼠随机分为两组：Control组(n=15,腹腔注射生理盐水)和DM组(n=105,腹腔注射STZ溶液,65mg/kg)。STZ注射48小时后,检测DM组大鼠尾静脉血糖水平≥16.7mmol/l为造模成功。DM大鼠每3天腹腔注射一次胰岛素(2-3U)维持血糖在16.7-25mmol/l以防止高糖诱导的死亡。12周后,DM大鼠随机分为以下7组(每组15只)：
NT组：不接受任何药物干预；S-Ang(1-7)组：200ng/kg-min的Ang(1-7)；M-Ang(1-7)组：400ng/kg·min的Ang(1-7); L-Ang(1-7)组：800ng/kg-min的Ang(1-7)；Valsartan组：30mg/kg·d的缬沙坦,灌胃给药；L+V组：800ng/kg-min的Ang(1-7)+30mg/kg-d的缬沙坦；L+A779组：800ng/kg·min的Ang(1-7)+800ng/kg-min的A779。Ang(1-7)和A779均采用植入式胶囊渗透压泵皮下包埋持续泵入的给药方式。药物干预前收集大鼠尿液并颈静脉穿刺收集空腹静脉血。药物干预4周,收集大鼠24小时尿液及空腹血液。 www.selleckchem.cn/products/KU-55933.html 3.2大鼠一般情况检测 实验结束后,测量各组大鼠的血糖、收缩压(SBP)、体重、肾重、24小时尿量、血液和尿液中肌酐含量并计算肌酐清除率。 3.3ELISA ELISA检测血清和尿液中的Ang(1-7)以及尿蛋白水平。 3.4SOD和MDA测量 分离肾小球,制备肾小球匀浆,检测肾小球组织SOD及MDA含量。 3.5组织病理学检测 大鼠肾脏组织切片,PAS染色计算肾小球硬化指数(GSI)。免疫组织化学染色检测肾小球内Ⅳ型胶原、TGF-β1、VEGF、PCNA和巨噬细胞含量。 3.6细胞培养
大鼠肾小球系膜细胞系(HBZY-1)分组：Control组：应用含5mmol/1葡萄糖的培养基培养,并加入20mmol/1的甘露醇以平衡渗透压；HG组：25mmol/1的葡萄糖刺激24小时；S-Ang(1-7)组、M-Ang(1-7)组和L-Ang(1-7)组：分别应用50、100和200nmol/1的Ang(1-7)预处理细胞1小时；Valsartan组：10-6mol/1的缬沙坦预处理细胞1小时；L+V组：200nmol/1Ang(1-7)+10-6mol/l缬沙坦预处理细胞1小时；L+A779组：200nmol/1A779预处理细胞半小时后加入200nmol/1Ang(1-7)处理1小时。所有药物干预组细胞在药物预处理后应用25mmol/1的葡萄糖刺激24小时,收集细胞。 HDAC activation 3.7Western blot 分离并提取肾小球蛋白,western blot检测NOX4、p47phox、PKCα、PKCβ1、 TGF-β1和p-Smad3的蛋白表达水平。提取大鼠肾小球系膜细胞系HBZY-1的蛋白,western 寻找更多 blot检测NOX4、p47phox、TGF-β1、p-Smad3、VEGF和IV型胶原。试剂盒分离并提取HBZY-1细胞的膜蛋白和胞浆蛋白,western
blot分别检测两者的PKCa和PKCβ1的蛋白水平。 3.8DHE、DCF和EdU荧光染色 各组HBZY-1细胞在实验结束时应用DHE和DCF染色检测ROS水平。EdU染色检测细胞增殖水平。 4结果 4.1血清和尿液中Ang(1-7)水平 Ang(1-7)干预治疗前,DM大鼠各组的血清和尿液Ang(1-7)水平显著低于Control组。但是Ang(1-7)干预后,血清和尿液中Ang(1-7)水平呈剂量依赖性升高。另外与NT组相比,缬沙坦组也能升高Ang(1-7)的含量。 4.2血压和血糖检测 DM大鼠的SBP较Control组显著降低,而DM大鼠各组间无显著性差异。DM大鼠血糖水平显著高于对照组,DM大鼠组间无显著性差异。 4.3Ang(1-7)改善肾脏功能 与Control组相比,体重和肌酐清除率在NT组显著降低而肾重／体重、24小时尿量、血清肌酐水平和24小时尿蛋白量在NT组却显著升高,提示DN造模成功。Ang1-7)、缬沙坦以及两者联合治疗均能改善上述指标。Ang(1-7)的效应呈剂量依赖性,而A779能阻断Ang(1-7)的上述作用。L-Ang(1-7)组和L+V组肾脏功能改善效果相似并且均优于Valsartan组。 4.4Ang(1-7)减轻肾小球硬化 PAS染色并根据其阳性面积计算GSI。结果发现,DM各组的GSI均显著高于Control组。与NT组相比,Ang(1-7)能剂量依赖性的降低GSI,而A779则能够阻断该作用。L-Ang(1-7)组与L+V组组间GSI无显著性差异,但是此两组的GSI水平均显著低于Valsartan组。免疫组化显示NT组肾小球内IV型胶原、TGF-β1、VEGF和PCNA含量均显著高于Control组。Ang(1-7)、Valsartan以及两者联合治疗均能降低上述指标,而且Ang(1-7)的治疗效应呈剂量依赖性,A779能阻断其作用。与Valsartan组相比,L-Ang(l-7)和L+V两组降低上述指标的作用更为明显,且两组间无显著差异。另外,肾小球内巨噬细胞浸润程度在各组间无显著性差异。 4.