01M磷酸盐缓冲液(PBS, selleck chemicals NaCl137mmol/L, KCl2.7mmol/L, Na2HPO44.3mmol/L, KH2PO41.4mmol/L, pH7.2～7.4)漂洗三次,每次3min;加入5%的BSA封闭1h。一抗anti-NR1antibody小鼠抗大鼠(millipore, USA1:250PBS稀释),第二个一抗anti-TNFR1/2antibody (Abcam,1:250PBS稀释)兔抗大鼠,孵育,室温过夜。漂洗3次,室温下闭光孵育AlexFluo488标记驴抗小鼠IgG (Invitrogen, USA), AlexFluo594标记驴抗兔IgG(Invitrogen, USA,1:1000PBS稀释)2h。漂洗3次。贴片,封片后用Olympus正置荧光显微镜进行观察并拍照。 研究内容 一共分为两部分 第一部分：形态学检测 1.将标有绿色荧光蛋白的病毒注入腰膨大显微镜下可见绿色荧光,说明病毒确实注入了细胞内。 2.显微镜下免疫荧光结果显示TNFR1或TNFR2与NMDA受体共定位。 第二部分：行为学和Western blot检测。 1.鞘内注射空载病毒对照组
将空载病毒(GFP)注射入大鼠的腰膨大,足底分别注射CFA或生理盐水。结果： 行为学的结果显示组,与组相比较,成年雄性大鼠的左侧足底皮肤下注射炎性致痛物质CFA后进行关于热痛行为的缩爪反应观察,PWL在脚掌注射后的第1d,3d,7d较对照组减少(P组相比,组,大鼠腰膨大处给予TNFR1-siRNA后,动物脚掌注射CFA后进行热痛行为观察,PWL在脚掌注射后第1d,3d,7d均明显延长(P组,鞘内给予TNFR1-siRNA后,脊髓背角TNFR1和p-NR1的表达减少。 3.鞘内注射TNFR2-siRNA组 将载有TNFR2-siRNA的腺病毒注射入大鼠的腰膨大,足底注射CFA或生理盐水。 结果： 行为学结果分析,与对照组相比,组大鼠给予TNFR2-siRNA后,脚掌射CFA引起的PWL在第1天明显延长(p组,鞘内给予能抑制TNFR2-siRNA,脊髓背角神经元TNFR2和p-NR1的表达减少。 4.鞘内注射TNFR1&/2-siRNA组 将载有TNFR1&2-siRNA注射入大鼠的腰膨大,足底分别注射CFA或生理盐水。 行为学结果显示：组,与
目的通过观察不同时间段肺组织中小窝蛋白-1(caveolin-1,
cav-1)、p-P38MAPK和IL-8的表达水平,探讨cav-1在机械通气所致肺损伤(VILI)发生中的作用。方法雄性Wistar大鼠24只,随机分为3组：对照组、大潮气量通气半小时组(H-VT0.5h组)和大潮气量通气2小时组(H-VT2h组)。在光镜下观察各组大鼠肺组织病理学改变,测定BALF总蛋白含量和肺湿/干重比值(W/D),采用免疫组织化学染色法测定肺组织cav-1、p-P38MAPK和IL-8的蛋白表达水平,并进行相关性分析。 结果 1.肺组织cav-1表达结果：H-VT0.5h组(0.142±0.014)和H-VT2h组(0.267+0.017)cav-1蛋白表达均明显高于对照组(0.118±0.010)(均P<0.01),H-VT2h组cav-1蛋白表达明显高于H-VT0.5h组(P0.05)。 因为 3.肺组织P-P38MAPK表达结果：H-VT2h组(0.514±0.031)p-P38MAPK蛋白表达明显高于对照组(0.148±0.016)和H-VT0.5h组(0.166+0.010)(均P0.05)。
4.肺组织cav-1、p-P38MAPK、IL-8相关性分析结果：各组大鼠肺组织中cav-1蛋白表达与p-P38MAPK之间呈正相关(r=0.787,P0.05)。 6.BALF总蛋白含量测定结果：H-VT2h组(0.620±0.140)BALF中总蛋白含量明显高于对照组(0.220±0.063)和H-VT0.5h组(0.300±0.140)(均P0.05)。 并且 7.肺组织病理学结果：随着机械通气时间延长,大鼠肺组织损伤程度呈逐渐加重趋势。结论 1.大潮气量机械通气诱导了cav-1的表达,早期(0.5h内)以保护作用为主,后期(2h后)以损伤作用为主。 2.cav-1通过激活P38MAPK信号通路,使IL-8等炎症因子表达增多,可能是导致VILI发生的重要途径之一。
目的： 1、建立新生鼠窒息模型，观察窒息后新生鼠血清心肌酶（CK、LDH）变化、心肌组织损伤及心肌细胞凋亡情况。 2、探讨窒息新生鼠缺氧缺血性心肌损伤过程存在AMPK信号通路的激活。 3、研究脂联素对窒息新生鼠缺氧缺血性心肌损伤的作用与心肌组织AMPK表达的影响，并探讨其可能的机制。 方法： 1、实验分组：50只7日龄新生SD大鼠按完全随机法随机分成5组（每组10只）：假手术组、窒息组、APN组、Compound C组、APN+Compound C组。 2、新生鼠常压窒息模型制备及药物干预：仅假手术组模拟常压窒息过程，不塞瓶及复氧，其余四组制备常压窒息模型，APN组及APN+Compound C组在窒息前半小时给予腹腔注射APN120μg/kg,Compound C组与APN+Compound C组在窒息前1小时给予腹腔注射Compound C20mg/kg,假手术组及窒息组分别接受同剂量的生理盐水。每组分别在复氧2小时后立即取血及心脏组织。 3、观察指标：检测血清心肌酶CK、LDH水平；HE染色观察心肌病理形态学改变；免疫组织化学染色法检测心肌组织AMPK蛋白表达含量；TUNEL法定性及定量分析心肌细胞凋亡。 4、数据分析：采用SPSS19.0统计软件进行统计分析，实验数据以均数标准差（x s）表示，采用单因素方差分析（one-wayANOVA），并进行方差齐性检验，两两比较用SNK-q检验，P＜0.05表示有统计学意义，P＜0.01表示有显著性差异。 结果： 1、各组血清心肌酶CK、LDH值比较：与假手术组相比，窒息组CK、LDH值显著升高（P＜0.01）；与窒息组相比，APN组心肌酶CK、LDH水平明显下降（P＜0.01），而Compound C组及APN+Compound C组CK、LDH值明显升高（P＜0.01）；但APN+Compound C组CK、LDH水平低于Compound C组，且差异显著（P＜0.