目的 肺成纤维细胞是放射性肺纤维化的效应细胞,基于前期的实验研究,本研究拟采用血清药理学的方法,通过观察养阴清肺方和激素对钴60射线照射后的人胚肺成纤维细胞的不同影响,证实养阴清肺方是否能抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,改变细胞生长周期,减少细胞因子TGF-β1及α-肌动蛋白的表达。阐明养阴清肺方是否通过影响细胞生长、细胞因子的分泌及蛋白的表达来减轻肺纤维化的发展,探讨养阴清肺方对放射性肺纤维化的作用,从而证实本方临床治疗放射性肺纤维化的有效性,为药物的进一步开发应用提供实验依据,推动中医药在治疗放射性肺纤维化中的应用。 这个 2.方法 本实验分为4组：中药组、激素组、中药加激素组、空白对照组,采用血清药理学方法,分别给4组Wistar大鼠灌胃,然后采集血清,分装、保存。采用钴60射线照射人胚肺成纤维细胞,然后用不同含药血清对照射后的肺成纤维细胞进行干预。 先采用不同照射剂量(分别为0Gy、3Gy、5Gy、8Gy)钴60射线照射人胚肺成纤维细胞,然后用MTT法检测不同照射剂量对细胞增殖的影响,选用对细胞增殖作用最强的照射剂量作为以下实验的照射量。 采用前一实验所得出的最佳照射剂量照射肺成纤维细胞,然后分别加入不同组别的含药血清培养,分别于24、48、72小时后检测每组细胞的增殖情况,评估不同药物对肺成纤维细胞的抑制率。 采用最佳照射剂量照射后,加不同含药血清培养,采用流式细胞技术分析肺成纤维细胞的凋亡及周期情况,分析细胞生长周期受不同药物干预后的变化情况以及不同药物对细胞凋亡的影响。 TGF-β1在肺纤维化的发生、发展过程中起着非常重要的作用,将细胞通过照射和含药血清培养后,采用ELISA试剂盒检测培养24、48、72小时后不同组细胞分泌的细胞因子TGF-β1的含量；分析不同药物对肺成纤维细胞自身分泌TGF-β1的影响。
α-肌动蛋白是肌成纤维细胞的特异性表达,而肌成纤维细胞在肺纤维化的发生发展过程中也起着很重要的作用。将细胞经过上述实验中的方法处理后,高内涵筛选方法观察α-肌动蛋白的变化情况,以分析不同药物对α-肌动蛋白表达的影响。 3.结果 经不同剂量(OGy、3Gy、5Gy、8Gy)射线照射后的各组的OD值与阴性对照组相比均有显著性差异(P<0.05),各实验组之间也有差异(P<0.05),且中药组、激素组、中药加激素组之间分别都有差异(P<0.05),且中药组、激素组、中药加激素组之间也有差异(P<0.05),中药组的作用最突出。在48小时这一时相,中药、激素、中药加激素组与空白组均有差异(P0.05),但这一时间点细胞的凋亡率均明显小于24小时的细胞凋亡率。在72小时这一时间点,中药、激素、中药加激素组各组与空白组均有差异(P<0.05);中药、激素、中药加激素组之间亦有差异(P0.05),其余各组之间均有差异(P0.05),其余各组之间均有差异(P0.05),中药组与激素组之间无差异(P>0.05),其余各组之间均有差异(P<0.05)；中药、激素两组分别与中药加激素组都有显著差异(P0.05)。
MDV3100购买 4.结论 肺成纤维细胞经射线照射后,增殖明显加快,且在0-8Gy的照射范围内,这一趋势与照射剂量成正相关,随着照射剂量的加大,细胞的增殖和存活率也增加。 中药加激素抑制细胞增殖的能力最明显,激素对细胞的抑制能力强于中药。在48小时内,药物对细胞的抑制率呈上升趋势；在48小时达到高峰；之后呈下降趋势。 各药物组均具有明显的促进照射后肺成纤维细胞凋亡的能力。在24小时时相,中药促进细胞凋亡的能力明显强于其它两组(激素组和中药加激素组),且这一时相各组药物促进细胞凋亡的能力最突出。
各组药物可能均是通过阻滞GO/G1期和G2/M期,减少S期而改变细胞周期,从而减少细胞的增殖并促进细胞的凋亡。 24小时内,中药组抑制细胞分泌TGF-β1的能力很微弱,激素联合中药组的作用较强。在48小时时相,中药抑制肺成纤维细胞分泌TGF-β1的作用最强。在72小时时相,激素联合中药组抑制其分泌TGF-β1的作用减弱,中药和激素均能抑制细胞分泌TGF-β。 各药物组均能减少经钴60照射后的肺成纤维细胞表达α-肌动蛋白,中药联合激素组抑制α-肌动蛋白表达的作用最强,中药和激素二者没有差异。
植物的耐逆性是信号网络中多个基因相互作用、共同调控的结果,为了更好地理解植物耐逆性相关机制,有必要研究植物基因在非生物胁迫情况下的表达模式。 利用基因芯片,本实验室建立了盐和非盐胁迫下的大豆基因表达图谱,比较了它们的表达差异,筛选出与耐盐胁迫有关的多个候选基因。本文从候选基因中克隆了一个锌指蛋白转录因子基因和一个蛋白激酶基因,对它们在耐逆性中的作用进行了研究。 主要研究内容和结果包括： 通过比较大豆盐及非盐胁迫下的基因表达差异,发现17个锌指蛋白家族基因和26个蛋白激酶家族基因在盐胁迫下上调表达。在上述上调表达的2类基因中筛选并克隆了1个锌指蛋白基因GmZnFl和1个蛋白激酶基因GmPK6,并进行了功能研究。 1GmZnF1的克隆与初步功能分析 EPZ-6438浓度 1.1GmZnF1基因的芯片结果验证 半定量RT-PCR分析表明,GmZnFl基因在盐胁迫下,表达量随着胁迫时间的延长,表达量逐渐增加。 1.2GmZnFl蛋白结构、性质及系统进化分析 GmZnF1基因编码的蛋白是典型的C2H2-ZnF蛋白,具有一个跨膜结构域,一个复杂性较低的区域和一个DPBB-1样结构域。GmZnF1蛋白的疏水性较强,推测可能含有跨膜结构域。GmZnFl和油菜RING型E3泛素连接酶的同源性较高(99.0%),与拟南芥中玉山筷子芥锌指家族蛋白有同源性(48.0%),并且与蒺藜苜蓿E3泛素蛋白连接酶有同源性(38.0%)。 1.3GmZnF1转录激活活性分析 利用酵母转录激活体系证明该蛋白具有转录激活活性,从而佐证了该基因是转录因子。 1.4GmZnFI基因表达模式分析 qPCR结果表明GmZnFI在大豆的根、茎和花中表达量最高,在叶片和种子中表达量较低,且其表达受ABA、盐胁迫、干旱和冷胁迫的明显诱导,在盐和旱诱导条件下的上调表达尤其明显。 1.5GmZnF1的克隆及拟南芥过表达株系的获得 从“圣豆9号”中首次分离了1个锌指蛋白基因CDS序列,命名为GmZnF1,序列长度分别为834bp,分别编码278个氨基酸。 克隆GmZnF1基因CDS全长,构建植物过表达载体,并转化筛选拟南芥,得到该基因的过表达纯系植株。 1.