猪诱导多能性干细胞的转录组分析 对LFB2i-piPSCs进行了mRNA和sRNA测序，并且和PEF、FGF2-piPSCs（能够产生嵌合体动物的piPSCs）数据进行了比较。mRNA-seq结果显示LFB2i-piPSCs表达高水平的SOX2,
L-MYC, ESRRB等基因以及相对低水平的POU5F1(OCT4), KLF4和NANOG基因。miRNAs分析表明LFB2i-piPSCs高表达与多能性相关的miR-17-92、miR-302b-367、miR-106a-363、miR-290家族中的miRNAs，低表达let-7家族中的miRNAs。 4.山羊NANOG启动子报告载体的构建和细胞多能性监控 ABT-888核磁共振 首先尝试用不同的培养条件进行了山羊ES样细胞的分离和iPS样细胞的诱导，并对获得的细胞进行了初步鉴定。之后克隆并验证了山羊NANOG近端启动子，将其与EGFP相连接构建了报告载体。通过细胞转染和显微注射证明该报告载体具备表达功能和组织特异性。将该载体稳定转染到山羊成纤维细胞中作为重编程的受体细胞，从而对山羊体细胞重编程过程进行监控。同时将该报告载体显微注射到山羊胚胎中用于监控山羊早期胚胎的发育进程。
胚胎干细胞（Embryonic stem cells, ESCs）主要来源于胚胎囊胚期的内细胞团，具有分化的多潜能性和自我更新能力。转录因子调控网络和表观修饰调节，包括microRNA（miRNA）调控，在ESC的多能性维持和分化调节中都发挥着重要的作用。2010年，研究发现维生素C能促进诱导干细胞（induced pluripotent stem cells, 而且 iPSC）产生，此后维生素C在诱导细胞重编程和ESCs调控领域的研究引起了广泛关注。研究表明，维生素C有利于促进ESCs多能性维持，改善iPSC的诱导效率以及提高iPSC的重编程质量。目前研究表明，维生素C主要调控干细胞的表观修饰，包括DNA甲基化和组蛋白修饰等。 本研究以小鼠胚胎干细胞J1（J1mESCs）和小鼠畸胎瘤细胞系F9为研究对象，结合转录组表达谱芯片分析、miRNA测序分析以及实验验证等方法，探索维生素C调控干细胞多能性维持的作用机理。 1.维生素C促进无饲养层J1mESCs的自我更新和克隆形态。在无LIF的干细胞培养液中培养J1mESCs，加入维生素C后，J1mESCs的克隆形态变大，碱性磷酸酶（alkalinephosphatase, AP）活性升高。而维甲酸（retinoic acid, RA）诱导分化后，J1mESCs克隆形态明显变小，周围出现大量分化细胞，AP活性也显著降低。重新加入维生素C后，干细胞克隆形态明显恢复，AP活性也恢复较高水平。表明维生素C有助于促进干细胞的自我更新，并能够拮抗RA诱导的干细胞分化。 2.维生素C能够促进小鼠J1mESCs多能性基因的表达，并下调一些与分化相关的细胞信号转导途径。 a）基因表达谱芯片证实维生素C有利于小鼠J1mESCs多能性基因表达。收集维生素C处理的J1mESCs，进行基因表达谱芯片分析，以寻找维生素C的下游调控基因。利用在线软件DAVID（Database
for Annotation, Visualization and Integrated Discovery）对实验数据进行GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes）分析，结果发现，维生素C广泛促进多能性基因的表达，其中包括Esrrb、Utf1、Klf4、Tcl1、Eras、Nanog等重要的多能性因子，同时下调分化相关转录因子的表达。上述结果得到实时定量PCR（qPCR）的验证。
b）维生素C激活核心多能性基因转录。分别构建小鼠Nanog、Oct4、Sox2、Klf4基因近端启动子萤光素酶报告载体，检测维生素C处理对这些启动子活性的影响。结果发现，维生素C能促进Nanog和Oct4近端启动子活性上升。同时qPCR和Western Blot验证表明，维生素C能够促进Nanog基因表达上升。 c）维生素C下调部分与细胞分化相关的信号转导途径。采用信号通路报告载体转染J1mESCs和小鼠F9细胞，加入维生素C后检测信号通路效应元件的变化。结果发现，维生素C下调NF-κB、JNK、Myc等与细胞凋亡、分裂、周期调控相关的细胞信号转导途径。 3.维生素C促进mESC中特异性miRNA的表达，并通过miRNA介导的基因表达调控，抑制与细胞分化和发育相关基因。 a） miRNA深度测序结果表明维生素C能促进mESC中特异性miRNAs的表达。收集维生素C处理的J1mESCs，在Illumina HiSeq2000平台上进行小RNA深度测序分析。结果发现，维生素C促进干细胞中miRNA整体表达水平，发生显著变化的miRNAs中，超过70%被上调，尤其是干细胞特异性miRNA簇，包括miR-290–295、miR-17–92、miR-106b–25等，许多Dlk1-Dio3印记区编码的miRNAs也能被维生素C显著上调，包括miR-143、miR-434、miR-540、miR-433等，而与分化相关的miRNAs表达则下调，如miR-470。上述结果得到miRNA PD0325901 花费 qPCR的验证。 b）筛选上述实验中维生素C上调的miRNAs，利用在线软件TargetScan预测靶标，并进行GO分析，发现这些靶标主要富集于调控细胞分化与发育相关途径。筛选miR-296,miR-361, miR-143, miR-331, miR-434部分靶标，利用双萤光素酶报告检测miRNA对靶标抑制作用以及qPCR验证靶标mRNA表达水平。结果表明，预测到的11条靶标序列，其中有9条能被相应的miRNAs抑制，同时，qPCR检测的4个靶基因mRNA水平，其中3个靶基因表达显著下调。说明预测具有较高的准确性，预测结果可以反映出miRNA的调控作用。 c）维生素C上调miR-296, miR-361, miR-143, miR-331, miR-434的表达，维生素C下调Kdm6b、Sox6、Klf13、Sox17等与调控发育相关基因，同时，这些上调的miRNA靶向抑制这些下调的基因。上述结果表明，维生素C通过介导miRNA表达抑制干细胞中与分化和发育相关的基因。 4.