中药血清的制备: SD大鼠30只,雄性,体重180～220g,6～8周龄。随机分为正常血清组、中药血清组,中药血清组给予大鼠消斑通脉合剂中药复方常规煎剂(含生药2g/ml),按35g/kg/d灌胃,每天灌胃两次,每次间隔12h;正常血清组灌服等体积生理盐水。连续灌胃7d,末次给药2次,中间间隔lh,最后给药后lh,水合氯醛麻醉,无菌操作下取血。血样常温放置4h后4℃过夜, 2000rpm离心15min,0.22um微孔滤膜过滤,分装于EP管中,-20℃保存备用,用之前56℃水浴灭活30min。 2.大鼠血管平滑肌细胞体外培养: 大鼠A10主动脉VSMC细胞株采用高糖DMEM培养基培养,其中含有10%的FBS,青霉素(100U/ml)和链霉素(100ug/ml),细胞在37℃、5%C02、饱和湿度条件下培养。每2～3天更换培养基一次。待细胞生长至80～90%融合时,进行传代。并经血管平滑肌肌动蛋白(α-actin)免疫组织化学鉴定。 3.MTT比色法测定消斑通脉合剂中药血清对VSMC增殖的影响

将细胞分为4组,即正常血清组、5%中药血清组、10%中药血清组、20%中药血清组,每组10个复孔,5%中药血清与10%中药血清为20%中药血清用正常血清稀释而成,每孔保持20%血清浓度。细胞于37℃、5%C02、饱和湿度条件下分别培养为24h、48h、72h后,在不同的终点时间均换成无血清DMEM100ul,并加入MTT(5mg/ml) Selleck DNA Methyltransferase 抑制剂 20uL,继续孵育4h后,吸弃培养液,然后加入二甲基亚砜(DMSO) 150uL/孔,放于水平摇床轻微震荡10 min;用酶标仪在490nm波长处测定24h、48h、72h每个时间点各组细胞的吸光度(OD值),结果取均值(空白孔调零);并计算细胞增殖抑制率。对不同时间点各组细胞的OD值结果进行统计分析,得出最佳给药浓度。

研究结果:MTT比色法结果显示,5%的中药血清组在24h、48h、72h时间点的与正常血清组比较,无统计学差异。而10%、20%的中药血清组在24h、48h、72h时间点的与相同体积分数正常血清组比较,其OD值在24h、48h、72h均有明显统计学差异,证明10%、20%的中药血清组具有抑制VSMC增殖的作用,在24h～48h之间表现最为明显。并且20%的中药血清组在24h、48h、72h时间点的抑制率均明显大于10%中药血清组,提示消斑通脉合剂中药血清呈时间和剂量依赖性的抑制VSMC增殖。 Torin 2购买 实验二消斑通脉合剂对大鼠VSMC细胞周期及相关调控蛋白的影响 研究目的:通过观察消斑通脉合剂中药血清对大鼠VSMC细胞周期分布及细胞周期相关调控蛋白的影响,了解消斑通脉合剂中药血清抑制VSMC增殖的作用机理。 研究方法:根据MTT的结果,选择最佳中药血清浓度,分为正常血清组、中药血清组分别对VSMC作用12h、24h,用流式细胞仪碘化丙啶(PI)染色法分析正常血清组、中药血清组VSMC在12h、24h时间点细胞周期分布情况,对12h、24h时间点的流式细胞仪分析结果进行统计分析;选择最佳中药血清浓度,分为正常血清组、中药血清组,分别对VSMC作用6h、12h、18h、24h后收集细胞,应用Western blot的方法检测VSMC中Cyclin Dl、Cyclin E、p27蛋白在不同时间点的表达变化,并对结果进行统计分析。 研究结果:流式细胞仪细胞周期分析结果表明,消斑通脉合剂中药血清在一定的范围内抑制VSMC由G0/G1期向S期转化,与正常血清组在12、24h两个时间点比较,中药血清组明显延缓了细胞周期进程,其G0/G1期比例较对正常血清组显著增多,而S期所占比例明显下降,使细胞周期阻滞于G1期。Western

blot检测结果显示消斑通脉合剂20%中药血清呈时间依赖性的明显延缓Cyclin Dl、Cyclin E蛋白表达,与正常血清组比较有显著性差异。中药血清组对p27蛋白在不同时间点的表达没有影响,但与正常血清组比较,在12h、18h、24h时间点有显著差异。 实验三消斑通脉合剂对大鼠VSMC增殖信号通路ERK的影响 研究目的:通过观察消斑通脉合剂中药血清对大鼠VSMC磷酸化ERK1/2蛋白的表达变化,探讨消斑通脉合剂中药血清抑制VSMC增殖作用的信号转导途径。 研究方法:选择最佳中药血清浓度,分为正常血清组、中药血清组分别对VSMC作用4h,分别在1h、2h、3h、4h收集细胞,应用Western blot的方法检测VSMC磷酸化ERK1/2蛋白表达变化。 研究结果:Western blot法检测结果显示:消斑通脉合剂中药血清可以降低VSMC中磷酸化ERK1/2蛋白的表达水平,与正常血清组比较有显著性差异。 实验四消斑通脉合剂对大鼠VSMC凋亡及Akt信号通路的影响 研究目的:通过观察消斑通脉合剂中药血清对大鼠VSMC凋亡及凋亡相关信号通路Akt蛋白表达变化的影响,探讨消斑通脉合剂中药血清诱导VSMC凋亡作用的信号转导途径。 研究方法:选择最佳中药血清浓度,细胞分为正常血清组、中药血清组分别对VSMC作用48h后,用透射电镜观察VSMC的超微结构改变;选择最佳中药血清浓度,细胞分为正常血清组、中药血清组分别对VSMC作用24h、48h后,应用流式细胞仪通过AnnexinV-FITC/PI双染方法分析VSMC在24h、48h凋亡率;选择最佳中药血清浓度,细胞分为正常血清组、中药血清组继续孵育4h,分别于1h、2h、3h、4h收集细胞,应用Western selleck化学药品 blot的方法检测磷酸化Akt蛋白表达变化。 研究结果:透射电镜观察结果显示:正常血清组细胞形态正常,细胞核仁形态规则,核仁清晰;中药血清组对VSMC作用48h后,出现了典型的细胞凋亡表现,如细胞核形态不规则,胞质浓缩,核仁消失,核染色质固缩,边集于核膜下,内质网肿胀等。流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染方法凋亡率检测结果示:中药血清组对VSMC作用24h、48h后,随着作用时间的延长VSMC凋亡率明显增加;在24h、48h两个时间点与正常血清组比较有显著性差异;中药血清组在24h、48h两个时间点比较亦有显著性差异。Western blot法检测结果:中药血清组可以降低VSMC磷酸化Akt蛋白的表达水平,与正常血清组比较有显著性差异。 结论 1.消斑通脉合剂中药血清通过阻滞VSMC由G0/G1期向S期转化,延缓细胞周期进程而达到抑制VSMC增殖的作用。 2.