体外原代培养的HUVECs，分为对照组和Notch信号阻断组，利用DCFH-DA荧光探针结合用流式细胞技术，检测细胞内ROS水平。分别在生理状态下以及缺血再灌注条件下细胞内活性氧（ROS）水平，并使用相关的抑制剂作用血管内皮细胞确定生理状况下，ROS的主要来源。 3.体外培养人原代HUVECs被分为六组：对照组（DMSO组），单纯Notch阻断组（GSI组），Notch阻断加NADPH氧化酶阻断组（GSI+DPI），Notch阻断加抗氧化剂组（GSI+NAC），单纯NADPH氧化酶阻断组(DPI)和单纯抗氧化剂组(NAC)。刺激后分别用MTT法检测细胞增殖；划痕法检测细胞迁移；结晶紫染色检测细胞黏附；细胞外基质胶（Matrigel）检测管腔形成。 4.体外原代培养的HUVECs，分为照组和Notch信号阻断组，经刺激48h，RIPA裂解收取蛋白，定量并变性后，蛋白印记法（Western-Blots）检测HUVECs相关蛋白表达水平变化。

【结果】 1．采用改良体外培养HUVECs培养方法，获得大量稳定血管内皮细胞，应用含5%胎牛血清的内皮细胞专用培养基（ECM）培养细胞，MTT法观察细胞生长曲线表明：细胞生长旺盛2-3d生长最快，4-6d可融合。利用流式细胞技术进行APC-CD31细胞Marker以及免疫组织化学进行Ⅷ因子染色鉴定，血管内皮细胞的纯度高达99.56%。 LY294002购买 2.体外原代培养的HUVECs，经GSI阻断Notch信号后，利用DCFH-DA荧光探针结合用流式细胞技术，结果表明：在生理状态下以及缺血再灌注条件下细胞内活性氧（ROS）水平明显升高。随后使用相关的抑制剂作用血管内皮细胞后，利用DCFH-DA荧光探针结合用流式细胞技术，结果发现：生理状况下，ROS的主要来源于细胞膜上的NADPH氧化酶。 3.体外培养的HUVECs，各组经刺激后分别用MTT法检测细胞增殖、划痕法检测细胞迁移、检测黏附及体外管腔形成。结果显示：阻断Notch信号通路后，HUVECs增殖明显增加；细胞迁移速度加快；黏附以及管腔生成增加；利用ROS清除剂以及NOX抑制剂后，细胞增殖明显减慢；划痕法检测细胞迁移；细胞迁移，黏附及管腔形成实验均得到相似结果。 4.体外原代培养的HUVECs经GSI阻断Notch信号48h后，蛋白印记法（Western-Blots）检测HUVECs相关蛋白结果显示：阻断Notch后，NOX4蛋白含量明显增加；VEGFR2，P38及ERK的磷酸化水平增加；SOD1蛋白水平未见明显变化。 【结论】 1．采用改良外培养HUVECs培养方法，获得大量稳定高纯度的HUVECs，为后续实验提供充足的细胞来源。 2.体外培养HUVECs，经GSI阻断Notch信号后，在生理状态下以及缺血再灌注条件下细胞内活性氧（ROS）水平明显升高；使用相关的抑制剂后，证实血管内皮细胞内ROS的主要来源来细胞膜上的NADPH氧化酶。 3.体外培养HUVECs，经GSI阻断Notch信号及各组经刺激后， HUVECs细胞增殖、迁移、黏附及管腔生成明显增加；利用ROS清除剂以及NOX抑制剂后，细胞增殖明显减慢；划痕法检测细胞迁移；细胞迁移，黏附及管腔形成实验均得到相似结果，说明Notch信号时通过调细胞内ROS的水平来影响血管内皮细胞生物学行为。 购买Ibrutinib 4.体外原代培养的HUVECs经GSI阻断Notch信号48h后，Western-Blots结果显示：HUVECs经GSI阻断Notch信号后，ROS水平增加是NOX4蛋白激活引起其产生增多而非SOD1对其清除减少引起的；增加的ROS通过引起下游VEGFR2，P38及ERK的磷酸化水平增加而引起下游一系列信号反应。
目的：

肝纤维化是多种慢性肝脏病变最终进展到肝硬化的一个重要中间过程，以肝星状细胞(hepatic

stellate cell，HSC)的活化和细胞外基质（extracel lular matrix,ECM）的大量沉积为主要特征。研究证实，Wnt信号通路在肝纤维化的过程当中起到了重要的作用，其中以Wnt/β-catenin研究的最多。中药肝复康是我校病理生理教研室经多年实验总结出的抗肝纤维化的经验方，已证实对Wnt/β-catenin通路和非经典的Wnt/Ca2+信号通路均有抑制作用。目前，在对肿瘤一些的研究中发现，Wnt/Ca2+信号通路能够对Wnt/β-catenin通路起到抑制的作用，即说明了这两条通路在有些肿瘤中并不是单一的产生作用，而两条通路之间也是可能存在某种相互关系，能够相互影响，但在对肝纤维化的研究中则主要研究的是每条通路与肝纤维化的发生发展可能存在的某些机制，但对这两条通路之间的相互关系却还不十分明确。SB216763是GSK-3β的抑制剂，使胞浆中β-catenin大量累积并入核，从而激活Wnt/β-catenin通路。本实验通过使用中药肝复康药物血清和SB216763干预培养的HSC，然后分析在肝纤维化发生发展过程中Wnt/β-catenin通路与Wnt/Ca2+信号通路之间的相互关系。 没有 方法： 用含10%胎牛血清的DMEM培养基在5%CO2混合气体、37℃的孵箱中培养，传代大鼠HSC-T6细胞株。待细胞条件成熟后，再用不含血清的DMEM培养基饥饿培养24h后分组加药。 在六孔板中将细胞随机的分为以下五组：正常血清组（含10%正常大鼠血清的DMEM培养基）；SB21676320μM组(含10%正常大鼠血清，SB2167632umol/L的DMEM培养基）；SB21676310μM组（含10%正常大鼠血清，SB2167631umol/L的DMEM培养基）：肝复康治疗组（含10%肝复康治疗组大鼠血清的DMEM培养基）；SB21676320μM加肝复康治疗组（SB21676320μM基础上用10％肝复康药物血清干预），用孵箱在37℃，5%CO2混合气体的环境中培养48h。 逆转录-聚合酶链反应（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)法检测HSC细胞中collagen I，collagen Ⅲ，a-SMA的表达和Wnt/Ca2+信号通路中的相关指标Wnt5a， Frizzled2，CAMKII， MPP-7mRNA相对表达量,免疫蛋白印迹法（western blot）检测细胞中MPP-7的蛋白表达量。实验结果均采用SPSS13.0统计软件分析。 结果： 1、SB216763与肝复康对大鼠HSC-T6细胞活性及a-SMA、I型、III型胶原的影响 1.1RT-PCR检测SB216763对大鼠HSC-T6细胞活性及a-SMA、I型、III型胶原的影响 SB21676310μM与SB21676320μM组HSC明显活化, I型胶原、 Ⅲ型胶原、a-SMA表达量与正常血清组相比显著增加，其中又以SB21676320μM组增多的更为明显，说明使用SB216763后HSC-T6细胞株有明显的纤维化倾向。 1.