38±0.41,1.10±0.22,1.50±0.50,1.60±0.89,每1000个细胞)明显低于Con组(3.60±0.89,每1000个细胞),(p
目前,肿瘤多药耐药(multi-drug Osimertinib细胞系 resistance, MDR)已成为肿瘤治疗中面临的一大难题,所谓肿瘤MDR是指肿瘤接触了某些抗癌药物后产生对其他多种未接触过的、结构无关和作用机制完全不同的抗癌药物也具有交叉耐药性。肿瘤MDR产生的机制十分复杂,主要包括：细胞凋亡敏感性降低、细胞存活信号通路的异常活化、药物外排泵ABC转运蛋白(P-glycoprotein,

P-gp等)过表达、药物作用靶点的改变、DNA损伤修复活性增强、药物解毒与消除酶活性增强或过表达等。 肿瘤MDR逆转剂是通过抑制转运蛋白的功能或表达,恢复耐药肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。与此不同,抗耐药药物则是通过直接杀伤或抑制耐药肿瘤克服肿瘤MDR。近年来,抗耐药研究越来越受到人们的重视。我国天然产物资源丰富,从天然产物及其衍生物中寻找新型抗耐药化合物或肿瘤MDR逆转剂具有广阔的前景。在此,我们发现汉防己甲素新型衍生物H1在体内、外均显示出良好的抗耐药作用,而且在无毒浓度时能显著逆转P-gp所介导的肿瘤MDR,并对其分子机制进行了初步探讨。 本论文主要分为两部分：第一部分,H1抗耐药药效学评价及其分子机制研究；第二部分,无毒浓度H1逆转P-gp介导的肿瘤MDR作用及对P-gp表达与功能的影响。 第一部分H1抗耐药药效学评价及其分子机制研究 本部分实验主要研究了汉防己甲素新型衍生物H1体内、外抗耐药作用及其对敏感株、耐药株细胞凋亡通路与存活信号通路的影响。采用MTT比色法测定H1对8株不同组织来源肿瘤细胞的细胞毒活性,再以KB、KBv200; MCF-7、MCF-7/adr;A549、A549/tax亲本与其相应的耐药细胞为研究对象,以三种常用的抗肿瘤药物阿霉素(ADR)、紫杉醇(TAX)、长春新碱(VCR)为对照,系统评价了H1体外抗耐药作用。建立敏感性KB、耐药性KBv200裸鼠移植瘤模型,以VCR为阳性对照药,结合KB裸鼠移植瘤模型考察KBv200裸鼠移植瘤模型的体内耐药性,进而采用KB、KBv200裸鼠移植瘤模型评价H1低、中、高(10、15、20mg/kg)三个剂量的抗肿瘤效果,评价H1体内抗耐药作用。PI单染法流式细胞仪检测H1对敏感株细胞KB、耐药株细胞KBv200细胞周期的影响。采用DAPI染色法观察细胞形态学变化；琼脂糖凝胶电泳分析细胞DNA片段化状态；PI-AnnexinV双染法定量检测H1诱导KB、KBv200细胞凋亡作用。JC-1染色法检测H1对KB、KBv200细胞线粒体膜电位的影响。H1处理KB、KBv200细胞24h后,Western

blot方法检测内源性凋亡通路相关蛋白：Bax、Bcl-2、Caspase-3、cleaved Caspase-3的表达及线粒体膜间隙蛋白细胞色素-C、AIF的释放；外源性凋亡通路相关蛋白：Fas、FasL、Caspase-8的表达；以及细胞存活性信号通路PI3K-AKT、MEK-ERK中关键分子p-ERK、ERK、p-AKT、AKT的表达。与此同时,以Bel7042/5-Fu细胞为研究对象,以5-Fu为对照,评价了Bel7042/5-Fu细胞的耐药特性及H1对Bel7402/5-Fu与Be17402细胞的生长抑制作用。采用Trizol法提取了Bel7402、Bel7402/5-Fu细胞及H1(4μM)处理细胞24h后的mRNA,以琼脂糖凝胶电泳进行RNA质量检测。采用Affimatrix基因表达芯片平台分析敏感株细胞Be17402,耐药株细胞Bel7402/5-Fu,以及H1处理后Bel7402、Bel7402/5-Fu细胞全基因组表达水平变化。 很少 研究结果显示：H1对8株不同组织来源的肿瘤细胞都具有不同程度的生长抑制作用,IC50在1-4μM之间,对KB、Bel7402的生长抑制作用较为显著,1C50分别为1.068±0.017、0.671±0.026(μM)。体外抗耐药作用研究显示H1不仅对敏感株细胞具有较好的杀伤作用,而且对耐药株细胞也同样具有显著的抑制作用,平均耐药因子(resistant

哪里 factor, RF)仅为1.6,而三种抗肿瘤药物’TAX、ADR、VCR的平均耐药因子分别为：22.6、71.7、52.3。可见,在体外H1具有良好的抗耐药作用。KB、KBv200裸鼠移植瘤实验表明：在敏感性KB裸鼠模型,VCR给药组的相对肿瘤体积抑制百分率、瘤重抑制百分率分别为：84.4%、82.1%,显示出良好的抗肿瘤效果。但在耐药肿瘤模型(KBv200裸鼠移植瘤模型)VCR给药组的相对肿瘤体积抑制百分率、瘤重抑制百分率则分别为：12.6、27.7%,KBv200细胞在体内仍然对VCR展现良好的耐药作用,证明建立的体内耐药移植瘤模型是成功的。H1无论在敏感性KB裸鼠移植瘤还是在耐药性KBv200裸鼠移植瘤模型都具有显著的抗肿瘤效果,并且显示良好的剂量依赖关系。尤其是H1高剂量组(即20mg/kg)对敏感株KB裸鼠移植瘤的相对肿瘤体积与重量抑制百分率分别为79.7%、79.0%；对耐药株KBv200裸鼠移植瘤的相对肿瘤体积与重量抑制百分率分别为61.5%、74.9%。可见,H1在我们建立的体内移植瘤耐药模型中仍具有良好的抗耐药作用。作用机制显示：H1对KB、KBv200细胞周期分布无显著影响,但我们观察到随着H1浓度的增加出现凋亡峰(Sub-G1)。DPAI染色显示细胞核皱缩、碎裂、染色加深,且凋亡细胞的百分率随着H1浓度的升高而增加。琼脂糖凝胶电泳检测到典型的DNA片段化(DNALadder)现象。PI-AnnexinV染色后发现H1诱导KB细胞的凋亡作用略强于耐药株细胞KBv200,8μM Hl处理组诱导KB细胞晚期凋亡百分率为85.4%,而诱导耐药细胞KBv200细胞晚期凋亡的百分率为42.