1%。GDC-0941作用后的EC9706细胞,GDC-0941各剂量组出现染色质聚集等典型的凋亡形态学改变。流式细胞仪检测显示：GDC-0941作用EC9706细胞后,引起EC9706线粒体膜电位的改变,导致细胞凋亡。且随GDC-0941剂量的增加EC9706细胞凋亡百分率逐渐增大。免疫印迹结果发现,与对照组相比,GDC-0941刺激EC9706细胞后,Bax蛋白表达减少,且随GDC-0941剂量的减少表达显著；而Bcl-2蛋白表达增多,且随GDC-0941剂量的增加表达显著增多。

什么 结论 (1) GDC-0941能显著抑制人食管癌EC9706细胞增殖,对细胞生长具有抑制作用。 (2) GDC-0941对人食管癌EC9706细胞增殖抑制及促凋亡的作用,呈现一定的剂量依赖方式。 (3) GDC-0941对人食管癌EC9706细胞的凋亡作用机制,可能与上调Bax蛋白、下调Bc1-2蛋白的表达相关。
自2010年以来,肺癌的靶向治疗取得了很大进展,出现了许多针对EGFR, MET, HER2, VEGF和ALK等靶点的小分子药物,尤其是针对EGFR的靶向药物在临床上显示了很好的疗效。但是仍有一部分患者耐药,难以从EGFR的靶向治疗中获益。这部分患者,细查原因,大部分是因为肿瘤细胞中存在KRAS突变[2],但往往还有其他基因女(?)PIK3CA和PTEN等基因的突变[3-5]。这些耐药的患者的治疗也成为了临床上的难点,本课题即致力于这一方面的研究。 自80年代在人类肿瘤中检出突变KRAS以来,因其与人类肿瘤的密切关系而备受关注,关于它的文献数以万计。大部分以临床肿瘤标本为研究对象,也有以多种KRAS突变肿瘤细胞系为基础进行研究的。为探讨KRAS突变患者能否从小分子靶向治疗药物中获益,我们选用KRAS突变肺癌的肿瘤细胞模型进行实验。为了明确细胞资源中心所保藏的肿瘤细胞系中KRAS及相关的BRAF,

EGFR, PIK3CA基因的突变情况,我们使用高分辨率溶解曲线技术(HRM)对库藏人类肿瘤细胞系进行突变的检测。 或者 首先,我们提取了173种肿瘤细胞的总DNA,根据以往文献报导KRAS、 PIK3CA、BRAF(?)(?)EGFR基因突变的热点所在的6个DNA片段,进行PCR扩增,获得高拷贝数的目标序列。然后进行高分辨率熔解。在时间和荧光的曲线上区分出野生型,突变杂合型和突变纯合型的细胞系。筛查结果显示在肿瘤细胞系中KRAS突变在所筛查的4个基因中最为常见,其中胰腺癌细胞系突变率为66.67%,结直肠癌细胞系为52.94%,肺癌细胞系为21.25%,是突变率最高的三种肿瘤细胞系,与文献报道的临床肿瘤患者中KRAS的突变频率相当：胰腺癌>80%,结直肠癌≈50%,肺癌10-30%[6] PIK3CA、BRAF、EGFR基因的突变在肿瘤细胞系中突变频率分别为14.45%、6.35%和4.62%。另外,我们还检测到了COC1、A875、SF767、TE671及PANC-1细胞系中的一些未见报导的基因突变情况。 筛查结果明确了KRAS及相关基因在人类肿瘤细胞系中的突变情况,为开展肿瘤的靶向治疗研究提供了很好的模型。同时证明HRM技术是一种低成本,灵敏,特异和高通量的实验手段。 根据前述突变检测结果,选择我们KRAS单突变的A549和KRAS/PTEN双突变的NCI-H157两株NSCLC细胞,观察两种信号通路抑制剂GDC-0941(PI3K/AKT/mTOR通路,PI3K抑制剂)和AZD6244(KRAS/RAF/MEK通路,MEK抑制剂)对不同突变的NSCLC细胞的用药效果。分别用不同浓度的GDC-0941和AZD6244单独或联合作用,MTT法初步观察对细胞增殖的影响。根据观察结果确定联合给药的浓度。设立无药对照组、P13K单独抑制组(GDC-0941,0.5/5.0μu

mol/L)、联合Ⅰ组(0.5μ mol/L AZD6244+0.5μ 和 mol/L GDC-0941)及联合Ⅱ组(5.0μ mol/L AZD6244+5.0μ mol/L GDC-0941)。细胞经过不同组合浓度的抑制剂作用后,MTT法绘制增殖抑制曲线；平板集落形成法检测集落形成能力的改变；流式细胞仪检测细胞凋亡率及周期分布；Western blot检测不同组中抑制剂靶点下游周期及凋亡相关蛋白表达的差异。 在两株NSCLC细胞中,单独抑制RAS/RAF/MEK通路或PI3K/AKT/mTOR通路效果较差。抑制剂AZD6244或GDC-0941作用于A549细胞的抑制率分别可达25.5%和38.1%,作用于NCI-H157细胞的抑制率分别可达16.9%和35.1%。Westernblot结果显示AZD6244抑制RAS/RAF/MEK通路后(降低pERK活化)激活PI3K/AKT/mTOR通路(增强pAKT活化)。相反,GDC-0941抑制PI3K/AKT/mTOR通路后激活了RAS/RAF/MEK通路。结果表明单通路突变的细胞,仅抑制该突变通路,效果差。未突变通路的抑制剂对肺癌细胞的增殖也有抑制作用。无论肺癌细胞是KRAS单突变,还是KRAS/PTEN双突变,单通路抑制效果较差,需要双通路联合抑制提高疗效。 RAS/RAF/MEK和PI3K/AKT/mTOR双通路联合抑制可增强KRAS/PTEN双突变的NSCLC细胞的生长抑制作用。在NCI-H157细胞中,低剂量的联合Ⅰ组表现为两药协同作用(q值=1.22),高剂量的联合Ⅱ组表现为两药相加作用(q值=0.