dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/）对热休克蛋白27、热休克蛋白70及热休克蛋白90α来源的HLA-A0201限制性CTL表位肽进行预测，用（http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com）系统对预测结果确认。合成出积分最高的四条肽段，用HLA-A0201+T2杂交瘤细胞验证肽段的亲和力及稳定性，进一步筛选出亲和力及稳定性最佳的两条肽段用来诱导肽段特异性细胞毒性T细胞产生。合成HLA-A0201-肽段四聚体用以检测Hsp-CTLs细胞阳性率。最后，我们给HLA-A0201转基因小鼠接种所筛选的热休克蛋白肽段，两周后处死小鼠取脾脏细胞，检测是否有热休克蛋白特异性细胞毒性T细胞产生并验证这些细胞毒性T细胞的功能。 结果：通过积分系统我们预测并挑选出积分最高的4条肽段，分别是热休克蛋白27相关肽段aa27，序列为RLFDQAFGL；热休克蛋白70相关肽段aa393，序列为LLLLDVAPL；热休克蛋白90相关肽段aa362，序列为KLYVRRVFI；热休克蛋白90α相关肽段aa670，序列为ALLSSGFSL。通过进一步T2细胞结合试验，我们筛选出结合力和稳定性最强的两条肽段aa27及aa670。我们通过四聚体检测健康供者及患者体内aa27及aa670特异性细胞毒性T细胞水平，发现患者体内aa27及aa670四聚体阳性细胞毒性T细胞水平较健康供者上升，证明筛选合成的肽序列为生理状态下产生的表位肽片段。

结论：所筛选的热休克蛋白肽段aa27及aa670与HLA-A0201分子亲和力最高，结合后稳定性最强，并且在患者体内可以检测到以上肽段特异性细胞毒性T细胞。将我

TGF-beta抑制剂 们筛选的热休克蛋白90肽段接种到HLA A0201转基因小鼠体内后我们检测到了热休克蛋白特异性细胞毒性T细胞，这提示我们筛选的肽段具有免疫原性。 第二部分体外验证细胞毒性T细胞对骨髓瘤细胞的细胞毒作用并研究其特性 目的：通过体外实验验证细胞毒性T细胞对骨髓瘤细胞的细胞毒作用并了解细胞毒性T细胞特性及细胞毒作用机制。 方法：用HLA-A0201+健康供者外周血诱导出肽段特异性细胞毒性T细胞，用HLAA0201+四聚体检测所肽段特异性细胞毒性T细胞水平，用流式细胞学方法检测细胞毒性T细胞表型及其分泌的细胞因子，用流式细胞学及CCK-8方法验证细胞毒性T细胞的增殖，用乳酸脱氢酶释放试验及流式细胞学方法验证细胞毒性T细胞分别对U266、ARH-77、RPMI8226、LP1细胞株及骨髓瘤原代细胞、HLA-A0201+健康供者PBMC的杀伤作用，用流式细胞学方法检测细胞毒性T细胞功能。 可能 结果：将外周血单个核细胞与肽段冲击过的自体树突状细胞共培养四周后，在共培养的淋巴细胞中可以检测到比例逐渐上升的四聚体阳性的细胞毒性T细胞，其比例由共培养前的不足1%上升到超过20%，这些淋巴细胞的表型也从低表达CD45RO

高表达CD45RA转换为高表达CD45RO低表达CD45RA，并且分泌IFN-γ。我们将 肽段冲击过的DC与T淋巴细胞共培养并与未经过肽段冲击过的DC与T淋巴细胞共培养作为对照，用CCK-8测试发现与肽段冲击DC共培养的淋巴细胞明显增殖，而 另一组没有增殖。我们将与肽段冲击过DC共培养的淋巴细胞分别与HLA-A0201+骨髓瘤细胞株及HLA-A0201-骨髓瘤细胞株共培养并设置空白对照，发现与ARH-77（HLA-A0201+）细胞共培养的T淋巴细胞发生明显增殖，而与LP1（HLA-A0201-）共培养及未与肿瘤细胞共培养的两组淋巴细胞无增殖现象。将这些淋巴细胞与不同细胞株、原代细胞或PBMC共培养后通过乳酸脱氢酶释放试验及流式细胞学检测，发现其对HLA-A0201+细胞株U266、ARH-77及HLA-A0201+骨髓瘤原代细胞有明显的细胞毒作用，而对HLA0201-的细胞株RPMI8226、LP1及来自健康供者的HLA0201+PBMC没有细胞毒作用，同时我们发现在杀伤过程中CD8+的CTL细胞表达CD107α水平明显上升，并且细胞毒作用通过perforin及granzyme B途径发挥作用。 结论：热休克蛋白肽段aa27及aa670可以诱导出该肽段HLA0201+细胞毒性T细胞，并且具有细胞活性，对HLA-A0201+的骨髓瘤细胞株及骨髓瘤原代细胞具有细胞毒作用，并通过Perforin及granzyme DNA Methyltransferase 抑制剂 B机制起作用。 第三部分验证Hsp-CTLs在原代多发性骨髓瘤动物模型SCID-rab中的抗骨髓瘤效应 目的：建立SCID-rab原代多发性骨髓瘤动物模型并验证Hsp-CTLs在动物体内的抗骨髓瘤作用。 方法：给10只6-8周雄性CB.17-SCID小鼠植入4周龄新西兰兔四肢扁骨，4-6周后将当天分离好的骨髓瘤患者原代CD138+骨髓瘤细胞注射入已植入的骨腔中，每周留取小鼠血样并检测轻链水平，每周进行X线照射观察植入兔骨变化，判断是否成瘤及决定治疗时机。成瘤后即开始按照分组情况通过鼠尾静脉注射Hsp-CTLs细胞。肿瘤注射起开始计算生存期，至肿瘤面积达到225mm2算作死亡。用脱颈方法处死肿瘤达到225mm2小鼠，取瘤组织行病理学免疫组化检测。小鼠全部死亡后计算生存期。 结果：在注射CD138+原代骨髓瘤细胞的9只SCID-rab小鼠中，4只成瘤，成瘤率44.