3USP2b对TBK1的K63位点泛素化影响 HEK293细胞转染Flag-USP2b或者USP2干扰RNA,以及Myc-TBK1、HA-Ub,使用Myc标签抗体做IP, Western blot检测TBK1的泛素化水平。 HEK293细胞转染Flag-USP2b和Myc-TBK1以及HA-Ub (K48)或者HA-Ub (K63),使用Myc标签抗体做IP,Western blot检测TBK1的泛素化水平。 HEK293细胞转染Myc-TBK1, HA-Ub和Flag-USP2b或者USP2bC67A,使用Myc标签抗体做IP,
Western blot检测TBK1的泛素化水平。 3.4USP2b对TBK1激酶活性的影响 HEK293细胞转染Flag-USP2b表达质粒或者USP2干扰RNA, SeV刺激6h,使用TBK1抗体做IP,检测TBK1激酶活性。 4. USP2b的抗病毒作用 HEK293细胞转染Contrl质粒、USP2b或者USP2b C67A,24h后进一步转染poly(I:C)或者PBS,8h后,VSV感染24后,收集培养细胞的上清(含VSV),剩余细胞提取RNA,上清做空斑试验,检测病毒滴度；RNA反转录成cDNA, E7080 real-time PCR检测细胞内VSV RNA复制。 HEK293或THP1细胞转染对照或者USP2干扰RNA,方法同上,分别检测病毒滴度以及VSV RNA复制。 5. USP2b在其他天然免疫信号通路中的作用 HEK293细胞转染USP2b质粒或者干扰RNA,同时转染TRIF, cGAS加STING和IFN-β-luc报告基因质粒,报告基因检测IFN-β-luc的活化。
THP1细胞转染对照或者USP2干扰RNA48h,分别用LPS、poly(I:C)刺激或者转染ISD12h, PCR检测IFN-β基因表达。 研究结果： 1.SeV感染HEK293或THP1细胞后,USP2表达下调 2. USP2b负向调控病毒诱导的I型干扰素IFN-β的表达。 2.1过表达USP2b抑制SeV诱导的IFN-β-luc的活性 2.2过表达USP2b抑制SeV诱导的IFN-β基因的表达 2.3过表达USP2b抑制SeV诱导的IRF3-luc的活性 2.4USP2b的点突变C67A不能抑制SeV诱导的IFN-β-luc以及IFN-β基因表达。 3.干扰掉USP2b后,增强IFN-β的表达 3.1USP2b的特异性siRNA可以干扰掉USP2b的表达(mRNA和蛋白水平)。 3.2干扰掉USP2b后,SeV诱导的IFN-β-luc活性以及IFN-β基因都增加。 4. USP2b靶向TBK1 USP2b抑制RLRs信号通路中的接头分子RIG-I,
MDA5, MAVS,TBK1活化的IFN-β-luc和IFN-β基因,而对IRF3-5D活化的IFN-β-luc和IFN-p基因表达没有影响。 DNA Damage抑制剂 5. USP2b能够对TBK1的K63位去泛素化 5.1USP2b与TBK1相互作用。 Selleck HKI272 5.2过表达USP2b降低TBK1泛素化水平,USP2b的点突变C67A则不能降低BK1泛素化。相反,干扰掉USP2b后,TBK1的泛素化水平增加。作为对照,USP2b对RIG-I和MAVS的泛素化水平没有影响。 5.3过表达USP2b能够减少TBKl的K63位泛素化水平。 6. USP2b消弱TBK1激酶活性 过表达USP2b消弱SeV诱导的TBK1激酶活性,相反,干扰掉USP2b后,SeV诱导的TBK1激酶活性增加。 7. USP2b负调细胞的抗病毒反应 过表达USP2b后,VSV病毒滴度以及VSV的RNA复制增加,相反,干扰掉USP2b后,VSV病毒滴度以及VSV的RNA受到抑制。 8. USP2b负调TLR3/4和DNA诱导的I型干扰素信号通路 过表达USP2b抑制TRIF(TLR3通路)以及cGAS加STING (DN A通路)诱导的IFN-p-luc活性,相反,干扰掉USP2b后,IFN-β-luc活性增加。THP1细胞中,干扰掉USP2b后,LPS (TLR4配体)、poly(I:C)(TLR3配体)以及ISD (DNA受体活化剂)刺激的IFN-β基因表达增加。 结论： 1.SeV刺激后,USP2b表达下调,USP2b负向调控病毒诱导的I型干扰素通路。 2. USP2b靶向TBK1,通过与TBK1相互作用,对TBK1进行K63位去泛素化。 3. USP2b负向调控细胞的抗病毒反应。 4. USP2b负调TLR3/4和DNA诱导其他天然免疫信号通路。 创新点和意义： 1.本研究首次证明USP2b可以负向调控IFN-β的产生及细胞的抗病毒反应。研究发现USP2b负向调控IFN-β的产生的机制是通过与关键激酶TBK1相互作用,进而去其进行K63位的去泛素化,从而抑制TBK1的活性。 2.由于TBK1作为病毒(包括RLRs,TLR3和DNA受体)诱导I型干扰素产生的关键激酶,USP2b可以广泛参与调控I型干扰素的表达及抗病毒反应。 3.