0软件设计PLGF、GAPDH两者的引物和Taqman探针 (2)利用Trizol试剂提取细胞总RNA (3)重组质粒pUCmT-PLGF的构建 (4)重组质粒pUCmT-GAPDH的构建 (5)real-time PCR检测人肺癌细胞系中PLGF的mRNA表达水平 二、PLGF沉默对小细胞肺癌细胞穿过血脑屏障的作用的研究 1、以腺病毒为载体的RNAi载体的构建 (1)含目的基因(siPLGF)的穿梭子(shuttle)构建 ①构建双链siPLGF：双链短发夹oligo DNA退火连接 ②线性化shuttle空载体与双链siPLGF的连接 ③重组质粒的转化、筛选和鉴定 (2)腺病毒的重组 ①线性化载体shuttle(si PLGF) ②shuttle和pAdEasy腺病毒载体共转化细菌BJ5183 ③重组子的筛选和鉴定 ④重组子(Ad-shuttle-siPLGF)的大量扩增 2、病毒颗粒的包装 (1) HEK293细胞的培养 (2)初级病毒颗粒的形成
(3)二级病毒颗粒的形成 (4)三级病毒颗粒的形成 (5)病毒颗粒滴度的测定 3、NCI-H250细胞的感染及沉默功能的鉴定 (1) NCI-H 250细胞的感染 (2) real-time PCR方法鉴定RNA干扰效果 4、具有PLGF沉默效应的NCI-H250细胞功能鉴定
(1)荧光定量方法检测有、无PLGF沉默效应的NCI-H250细胞穿过HBMEC单层的情况 更多 (2)检测有、无PLGF沉默效应的NCI-H250细胞对体外血脑屏障模型跨膜电阻抗(TEER)的影响 {Selleck Anti-infection Compound Library|Selleck Antiinfection Compound Library|Selleck Anti-infection Compound Library|Selleck Antiinfection Compound Library|selleck Anti-infection Compound Library|selleck Antiinfection Compound Library|selleck Anti-infection Compound Library|selleck Antiinfection Compound Library|Anti-infection Compound Library|Antiinfection Compound Library|Anti-infection Compound Library|Antiinfection Compound Library|Anti-infection Compound Library|Antiinfection Compound Library|Anti-infection Compound Library|Antiinfection Compound Library|Anti-infection Compound Library|Antiinfection Compound Library|Anti-infection Compound Library|Antiinfection Compound Library|Anti-infection Compound Library|Antiinfection Compound Library|Anti-infection Compound Library|Antiinfection Compound Library|Anti-infection Compound Library|Antiinfection Compound Library|buy Anti-infection Compound Library|Anti-infection Compound Library半抑制浓度|Anti-infection Compound Library价格|Anti-infection Compound Library花费|Anti-infection Compound Library溶解度|Anti-infection Compound Library购买|Anti-infection Compound Library制造商|Anti-infection Compound Library查找购买|Anti-infection Compound Library订单|Anti-infection Compound Library mouse|Anti-infection Compound Library chemical structure|Anti-infection Compound Library分子量|Anti-infection Compound Library molecular weight|Anti-infection Compound Library数据表|Anti-infection Compound Library supplier|Anti-infection Compound Library体外|Anti-infection Compound Library细胞系|Anti-infection Compound Library concentration|Anti-infection Compound Library nmr|Anti-infection Compound Library体内|Anti-infection Compound Library clinical trial|Anti-infection Compound Library cell assay|Anti-infection Compound Library screening|Anti-infection Compound Library high throughput|buy Antiinfection Compound Library|Antiinfection Compound Library半抑制浓度|Antiinfection Compound Library价格|Antiinfection Compound Library花费|Antiinfection Compound Library溶解度|Antiinfection Compound Library购买|Antiinfection Compound Library制造商|Antiinfection Compound Library查找购买|Antiinfection Compound Library订单|Antiinfection Compound Library chemical structure|Antiinfection Compound Library数据表|Antiinfection Compound Library supplier|Antiinfection Compound Library体外|Antiinfection Compound Library细胞系|Antiinfection Compound Library concentration|Antiinfection Compound Library clinical trial|Antiinfection Compound Library cell assay|Antiinfection Compound Library screening|Antiinfection Compound Library high throughput|Anti-infection Compound high throughput screening| (3)检测有、无PLGF沉默效应的NCI-H250细胞对体外血脑屏障模型通透性的影响：HRP通过率分析 (4)免疫荧光法观察有、无PLGF沉默效应的NCI-H250细胞穿过HBMEC单层时对紧密连接结构蛋白ZO-1的影响 三、PLGF改变脑微血管内皮细胞间紧密连接的分子机制的研究 1、检测PLGF重组蛋白对体外培养的HBMEC单层渗透性的影响 (1) Trailswell体外血脑屏障模型的建立 (2)检测PLGF对体外血脑屏障模型跨膜电阻抗(TEER)的影响 (3)检测PLGF对辣根过氧化物酶(Horse-radish peroxidase，HRP)穿过率的影响 2、观察PLGF重组蛋白对HBMEC间紧密连接结构的影响 (1)免疫荧光法观察PLGF对体外培养的HBMEC间紧密连接(tightjunction，TJ)结构蛋白ZO-1的影响 (2) Westem blot方法检测PLGF对体外培养的HBMEC间紧密连接结构蛋白occludin的影响 3、观察PLGF重组蛋白对Rho酪氨酸激酶活化的影响 (1)观察ROCK，Rho，PI3K，PKC，ERK抑制剂作用下，PLGF对HBMEC的诱导作用 (2) Pull-down方法检测Rho酪氨酸激酶的活化情况 (3) Westernblot方法检测cofilin的变化情况 4、免疫荧光法观察HBMEC细胞骨架微丝的变化
结果 一、PLGF在肺癌中的表达 1、免疫组织化学方法检测PLGF在肺癌组织标本中的表达 (1)对72例SCLC、45例人肺腺癌、24例人肺鳞癌和5例癌旁组织标本进行免疫组织化学染色，结果显示，在小细胞肺癌、肿鳞癌和肺腺癌中均有PLGF阳性细胞表达。 (2)对免疫组织化学染色结果进行灰度扫描，对Integrated OD Average值做t-检验，PLGF在肺腺癌中高表达；在SCLC和肺鳞癌中表达略低于肺腺癌。 (3)在72例SCLC中，有20例(27.8％)PLGF高表达，52例(72.2％)PLGF低表达；对PLGF高达表组和PLGF低表达组患者淋巴结转移数目进行比较，p＜0.05，存在统计学意义。 2、RT-qPCR检测肺癌细胞系中PLGF mRNA的表达情况 六株组织学不同、来源不同的肺癌细胞系中，PLGF 不 mRNA表达水平不同：NCI-H 250细胞(来源于SCLC脑转移灶的细胞株)PLGF高表达；NCI-H 209细胞(来源于SCLC骨髓转移灶的细胞株)PLGF表达略低；NCI-H 446(来源于SCLC胸水渗漏的细胞株)PLGF低表达；A549(肺腺癌细胞系)和BE1、LH7(大细胞肺癌)PLGF也呈低表达。 二、PLGF沉默对小细胞肺癌细胞穿过血脑屏障的作用的研究 1、以腺病毒为载体的RNAi系统的构建 成功构建了携带短发夹siPLGF的穿梭载体：shuttle(siPLGF)，并与腺病毒骨架载体成功重组，获得了六个腺病毒RNAi重组子(Ad-shuttle-siPLGF)。 2、完成HEK293细胞三次病毒包装并获得了纯化病毒颗粒，含量为1.5×10~11virus。 3、AD-shuttle-si PLGF感染NCI-H 250细胞 (1)利用携带si-PLGF腺病毒颗粒感染NCI-H250细胞，感染率可达80％。 (2)利用RT-qPCR检测感染病毒颗粒的NCI-H250，Ad-shuttle-si PLGF细胞与Ad-shuttle-scramble组细胞相比，PLGF mRNA表达明显降低，并存在统计学意义(p＜0.