05)；平均SCC由低到高排序为：Se-Pro组< Na2SeO3组
结果：Apelin干预人脐静脉内皮细胞后ICAM-1、VCAM-1和MCP-1 mRNA水平明显增高,10-8M作用最强。ICAM-1表达在4h达最高,表达曲线呈钟形,VCAM-1和MCP-1表达随干预时间延长渐增强,分别于12h和24h达峰值。 结论：Apelin呈浓度和时间依赖性刺激内皮细胞粘附分子ICAM-1和VCAM-1以及趋化因子MCP-1的表达,apelin所引起的内皮细胞炎症反应提示其可能是一种促动脉粥样硬化因子。 目的：应用RNA干扰技术沉默人脐静脉内皮细胞APJ基因的表达,研究APJ基因沉默后apelin调节人脐静脉内皮细胞表达粘附分子和趋化因子的变化,初步阐明apelin-APJ系统在细胞学水平上对动脉粥样硬化形成的可能调节机制。
方法：针对人APJ cDNA编码序列设计shRNA (small hairpinRNA,短发夹RNA)表达框,以pGenesil-1 vector为载体构建质粒,并设阴性对照质粒。以脂质体为介导对培养的人脐静脉内皮细胞进行稳定转染,检测转染细胞APJ RAD001 mRNA和蛋白表达鉴定基因沉默效率。以未转染空白对照、转染阴性siHK质粒和转染siAPJ-2质粒的人脐静脉内皮细胞为研究对象,apelin分别干预三组细胞后,应用荧光定量PCR检测粘附分子ICAM-1和VCAM-1以及趋化因子MCP-1mRNA表达,蛋白免疫印迹实验检测蛋白表达。 时间 结果：APJ基因沉默后,与未转染空白对照、转染阴性siHK质粒的人脐静脉内皮细胞比较,apelin诱导的内皮细胞粘附分子ICAM-1和VCAM-1以及趋化因子MCP-1表达增高被显著抑制(ICAM-1被抑制程度超过90%)。 结论：APJ作为apelin受体在内皮细胞被诱导表达粘附分子和趋化因子增高这一反应过程中的地位是不可或缺的,apelin-APJ系统所引起的内皮细胞炎症反应为其促动脉粥样硬化机制提供了细胞学证据。 目的：阐明JNK (c-Jun N-terminal Kinase, c-Jun氨基末端激酶)和NF-κB (nuclear factor-kappa B,核因子κB)信号分子是否参与以及如何参与apelin-APJ所导致的内皮细胞炎症的调节过程。 方法：apelin分别干预人脐静脉内皮细胞0、5、15、30、60和120 min。提取细胞磷酸化蛋白行蛋白免疫印迹实验检测p-JNK表达；提取细胞核蛋白和胞浆蛋白行蛋白免疫印迹实验分别检钡NF-κB-p65和IκBa表达。以JNK抑制剂SP600125和NF-κB抑制剂SN50分别预处理人脐静脉内皮细胞后提取细胞总RNA行逆转录和荧光定量PCR检测粘附分子ICAM-1和VCAM-1以及趋化因子MCP-1表达变化。
结果：Apelin在60min激起p-JNK表达高峰,胞核NF-KB-p65蛋白在60min也出现最强信号,胞浆IκBa蛋白表达水平于30min出现谷底状表达。JNK抑制剂和NF-κB抑制剂预处理细胞抑制apelin诱导的粘附分子ICAM-1和VCAM-1以及趋化因子MCP-1表达。 结论：Apelin通过磷酸化激活JNK和促进NF-κB转录因子活化核转位这两条信号通路引起内皮细胞表达粘附分子和趋化因子增强的炎症反应,为进一步研究apelin-APJ促动脉粥样硬化机制打下了基础。
胰岛素和运动均促使葡萄糖转运子4转位到细胞膜上,转运更多的葡萄糖进入细胞而调节细胞的葡萄糖摄取量。相对于胰岛素,对运动／肌肉收缩刺激骨骼肌摄取葡萄糖的机制了解较少。 目前研究运动／肌肉收缩多应用转基因动物,费用昂贵,而且不能应用基因沉默等技术。而培养的细胞株则没有诸多限制,可单独分析细胞内信号转导,排除血液循环成分和血液动力学因素的影响,更好地理解锻炼如何改善胰岛素作用。目前广泛应用的L6骨骼肌细胞不具收缩能力。具收缩能力的C2C12骨骼肌细胞仅表达少量的GLUT4,使得运动调节葡萄糖转运的研究,因缺少合适的肌肉模型而受到限制。本研究的目的是建立C2C12GLUT4myc细胞株,并应用此细胞模型探讨运动／肌肉收缩刺激骨骼肌细胞GLUT4运输的机制。研究内容和方法： selleck激酶抑制剂 第一部分建立C2C12GLUT4myc细胞株；检测分化能力和GLUT4myc的表达量,确定分化能力强并高表达GLUT4myc的细胞株。与L6GLUT4myc比较膜蛋白和信号分子以及GLUT1的表达；免疫荧光检测GLUT4myc在细胞中的定位；测定此细胞响应胰岛素刺激的GLUT4转位的时间曲线和剂量曲线。 第二部分比较carbachol、AICAR和胰岛素刺激的C2C12GLUT4myc肌管葡萄糖摄取和GLUT4转位,并观察三种刺激物作用的叠加性。通过使用各种信号蛋白的抑制剂,分析刺激GLUT4转位的信号机制。 第三部分比较三种刺激物对信号分子的作用,检测信号分子的活性。结果： 建立了C2C12GLUT4myc细胞株,GLUT4myc的表达量与L6GLUT4myc中的GLUT4myc量接近,约为小鼠骨骼肌GLUT4的10倍。C2C12GLUT4myc细胞表达IRAP和TfR的量高于L6GLUT4myc, VAMP2和VAMP7的表达在两种细胞中接近。C2C12GLUT4myc细胞表达AS160、AMPKα2和GLUT1高于L6GLUT4myc细胞,而Akt1和Akt2的表达则低于L6GLUT4myc。两种细胞表达AMPKα1、Akt3和PKC的量相近。GLUT4myc主要分布于细胞核周围。C2C12GLUT4myc细胞的葡萄糖摄取和GLUT4转位对胰岛素的作用呈剂量和时间依赖关系,最大值为基础状态的1.63±0.05倍。 比较carbachol、AICAR和胰岛素刺激的C2C12GLUT4myc肌管葡萄糖摄取和GLUT4转位,并观察三种刺激物作用的叠加性的结果显示,carbachol刺激葡萄糖摄取和增加细胞表面GLUT4myc含量,使之分别增加为基础组的1.60±0.