5小时后,白花丹素的绿色荧光已可在细胞浆中发现。12小时后,绿色荧光出现在细胞核周围。24小时后,仅剩细胞外的绿色荧光。 结论 1、白花丹素以浓度依赖方式抑制A549及H23细胞的生长。 2、白花丹素诱导A549及H23细胞的细胞周期停滞。可能与白花丹素抑制细胞生长有关。细胞周期停滞可部分归因于Cdc2及cyclinB1的下调。
3、白花丹素在A549细胞中可通过上调p53而增加p21的水平,在H23细胞中却无此作用。这可能与H23细胞中p53基因(M246I)的突变而引起该蛋白部分失活有关。 4、白花丹素在A549及H23细胞中均诱导caspase-3及caspase-9的激活并最终导致细胞凋亡性死亡。 5、白花丹素在A549及H23细胞明显增加细胞内活性氧化物的水平。而在予活性氧化物清除子预处理后,细胞内活性氧化物的水平明显降低。 6、白花丹素在A549及H23细胞通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路诱导细胞自噬。 7、Chloroquine, bafilomycin及wortmannin抑制白花丹素诱导的细胞自噬。 8、SB202190及SB203580通过增强PI3K/Akt/mTOR通路的抑制增加白花丹素诱导的细胞自噬。 9、在白花丹素诱导的细胞凋亡与细胞自噬间有交互联系,白花丹素能被细胞完整而迅速地吸收,并分布于细胞质及细胞核。
研究背景：
Pazopanib 海水淹溺是导致急性肺损伤（acute lung injury，ALI）的常见病因。生活中，有很多因素可以导致ALI的发生，如异物误吸，传染性肺炎、毒物接触等等，这其中就包括淹溺，尤其是海水淹溺。淹溺诱发的肺损伤多是由于气道内被动吸入过多液体，破坏了肺泡结构，导致肺水清除功能和气体交换功能下降，最终发生肺水肿和通气\血流比例下调，出现进行性低氧血症和呼吸窘迫，严重者会进展成急性呼吸窘迫综合症（acute respiratory distress syndrome，ARDS），甚至死亡。近年来，关于海水淹溺性急性肺损伤的研究大量展开，但都是基于动物模型基础上的研究，关于其中的致伤机制也陆续被揭示。 凋亡是一种由基因控制的程序性细胞死亡过程。生理情况下的凋亡对于维持机体新陈代谢，促进内环境稳定有积极作用；病理情况下的凋亡尤其是过度凋亡，会导致死亡物质大量堆积，死亡物质的清除引起吞噬细胞的集聚，促使炎症介质大量释放，加重肺损伤。最近，ALI中肺泡上皮细胞凋亡的研究被大量报道。我科前期的研究发现，在海水吸入型急性肺损伤(seawater 可能 inhalation 点击此处 induced acute lung injury，SWI-ALI）中，肺泡上皮细胞及内皮细胞的凋亡是增加的[1]。诱发细胞凋亡的因素有很多，调节通路更是多种多样。野生型p53（wild type p53，wtp53）是调节细胞凋亡的重要因子，SWI-ALI中，wtp53基因及其调节通路是否参与了海水诱导的细胞凋亡，及相关作用机制未曾揭示。 实验目的： 通过复制SWI-ALI大鼠模型，观察海水吸入后对肺组织上皮细胞凋亡的影响，同时观察野生型p53和其调节的凋亡相关基因及p38基因在海水作用时的表达，探讨在海水吸入型肺损伤发生后野生型p53诱导肺上皮细胞凋亡的作用机制，并进一步研究了海水触发野生型p53表达的机制。
实验方法： 实验一：40只SD大鼠随机分为空白对照组、海水1、3、6、12h组，每组8只。4个海水处理组大鼠气管内注入4ml/kg海水，分别作用1h、3h、6h和12h；对照组除不吸人海水外，其余处理同海水淹溺组。于各时间点上放血处死大鼠，行动脉血气分析，测肺湿/干重比（W/D)， HE染色观察肺组织病理形态改变，RT-PCR检测wtp53、Bax、Bcl-2及细胞色素c（cytochrome-c，Cyt-c）mRNA的表达，免疫组化法分析wtp53、p-p38和Bax表达变化，western blotting分析wtp53、p38和p-p38、p-p53、Bax、Bcl-2和Cyt-c及活化caspase-3的蛋白表达。 实验二：新传代的细胞常规培养4天后干预。除对照组外均在培养基中加入海水，海水干预浓度为40%（即1ml总体积中含0.4ml海水），孵育时间为3h；实验设对照组、海水组、海水+PFT-α组、海水+SB203580组、海水+DMSO组，在加入海水后，立即将20μM的PFT-α、SB203580及10μl的DMSO加入培养基中共同孵育。流式细胞仪检测各组细胞凋亡，Western blotting检测各组p-p38、p-p53和其相关下游目的蛋白的表达。 实验结果： 实验一：海水吸入后，血气结果显示大鼠出现了明显的低氧血症，HE结果示肺组织破坏严重，且海水作用时间越久，肺组织损伤越严重；海水吸入引起促凋亡基因wtp53、Bax及Cyt-c的mRNA表达增加（P0.