人根尖牙乳头感干细胞的分离、培养及鉴定 选取因正畸原因而拔除的年轻患者第三磨牙，分离培养人原代SCAPs,有限稀释法纯化获得单克隆的细胞；免疫组织化学染色及流式细胞仪鉴定间充质干细胞标记物STRO-1等；成骨诱导、成脂诱导实验证实细胞的多向分化能力。 Pifithrin-α数据表 2.转录因子NFIC促进SCAPs分化能力 构建NFIC慢病毒真核表达载体plenti-NFIC后，与沉默NFIC的siRNA分别转染SCAPs。过表达NFIC还促进SCAPs的增殖能力、ALP活性和成骨/牙分化能力。此外，NFIC还不同程度地增强矿化基因标记物ALP、OCN和Col.I的mRNA；蛋白质印迹免疫检测技术也证实NFIC上调DSP蛋白水平。而沉默NFIC,则明显抑制SCAPs矿化能力及矿化基因ALP、OCN和Col.I的表达。此外，过表达NFIC增强脂滴的形成和成脂标记物CCAAT增强结合蛋白（CCAAT/enhancer

binding protein）C/EBP-β、C/EBP-δ和过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor-y，PPAR-γ）的表达。 体内研究进一步证实：过表达NFIC的SCAPs细胞复合胶原/煅烧牛骨(calcinedbovine bone，CBB)材料植入免疫缺陷型小鼠的皮下12周后，可促进形成类成牙本质细胞和牙本质样结构。 3.转录因子NFIC参与TGF-β1信号通路对SCAPs的调控 不同浓度TGF-β1均抑制SCAPs增殖和体外矿化结节形成，并下调矿化基因的表达，而分别应用TGF-β1Ⅰ型受体抑制剂SB431542和Smad3的抑制剂SIS3阻断TGF-β信号通路后，可部分逆转TGF-β1对SCAPs增殖和分化的抑制作用。TGF-β1抑制NFIC蛋白的表达，过表达NFIC减弱TGF-β1对SCAPs矿化能力的抑制作用，而沉默NFIC则增强了TGF-β1对SCAPs成牙/骨的分化能力。实验结果显示NFIC参与TGF-β1信号通路对SCAPs的生物学调控。 综上所述，本研究通过体内/外实验证实NFIC可以促进根尖牙乳头干细胞的增殖和分化能力；而TGF-β1则起抑制作用；且NFIC参与了TGF-β1对根尖牙乳头干细胞分化特性的调控。本实验结果为阐述NFIC在调控SCAPs定向分化中的重要作用；同时为进一步研究SCAPs在牙髓牙本质再生和生物学牙根的组织工程研究提供了新的研究思路。
诱导性多能干细胞(Induced

有 Pluripotent Stem Cell,iPSC)是近年来干细胞研究领域中具有里程碑意义的突破。由体细胞重编程而来的hiPSC为获得与患者自身遗传背景一致的多能干细胞增加了一个新途径,是再生医学和组织工程、疾病模型、药物筛选的理想种子细胞,具有广阔的临床应用前景。而hiPSC体外培养条件是否合适则是决定其是否具有应用前景的前提,因此也是研究者关注的热点。 hiPSC的培养包括了体细胞重编程为hiPSC的过程(称为hiPSC的诱导培养)和hiPSC的扩增培养两个过程。“合适”或者“理想”的hiPSC的培养条件不仅要在扩增培养时维持hiPSC的生物学特性、符合临床应用前景,还包括这种培养条件是否可同时支持体细胞重编程。目前主要使用小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse

MDV3100体外 Embryonic Fibroblast,MEF)作为滋养层支持hiPSC的培养,但是这种含有鼠源性细胞的培养体系含有许多潜在的微生物感染风险,并且不可避免的带有异源细胞和蛋白,限制了hiPSC潜在的临床应用价值。因此,仍有待进一步探索“合适”或者“理想”的hiPSC诱导和扩增培养条件。我们关注于用人源性细胞作为滋养层用于hiPSC的诱导和扩增培养。 第1章人骨髓间充质干细胞作为滋养层培养hiPSC方法的建立和研究 人间充质干细胞(human Mesenchymal Stem Cell,hMSC)是一种具有多向分化潜能的成体干细胞,可以从少量的骨髓或其他许多组织样本中分离获得,可在分成纤维细胞重编程。因此,我们研究了自身成纤维细胞是否可作为滋养层支持hiPSC的诱导和扩增培养,并研究以自身成纤维为滋养层诱导培养的hiPSC的生物学特征。 我们从两个需做包皮环切术儿童手术后废弃的包皮中分离到两株包皮成纤维细胞,对二者均进行了相关研究。将HFF转导携带有Klf4、Sox2、Oct4和c-Myc转录因子的逆转录病毒后,不再作消化收集,而是在原来的体系中用hiPSC培养液一直培养。我们观察到,转导病毒后,大部分的成纤维细胞形态上并没有发生改变,且仍具有较强的增殖能力。9-10天后,小部分成纤维细胞聚集成小簇,细胞形态变短变宽,向上皮样转变,核仁明显。约3周后,部分小簇形成较大致密的克隆样细胞团块。这些克隆挑选后可继续在自身HFF滋养层上扩增,形成典型的hESC形态。表明在重编程过程中,未发生有效重编程的自身成纤维细胞可以作为滋养层支持其他成纤维细胞的重编程。 我们主要检测了扩增后其中一个克隆的特性,免疫荧光检测结果显示这些在自身HFF滋养层上培养的hiPSC表达未分化hESC特有的表面标记,如SSEA-4、 TRA-1-60、TRA-1-81和NANOG;RT-PCR检测显示内源性KLF4、SOX2、c-Myc.