应用免疫组化S-P法和双酶法检测CD40-CD40L、ICAM-1-LFA-1蛋白在GO患者眼眶组织中的表达;原代培养GO患者及正常人的眼眶成纤维细胞并用免疫组化技术检测其表面的CD40和ICAM-1。 2.应用RT-PCR方法检测CD40L诱导OF合成ICAM-1的mRNA水平;应用酶联免疫吸附测定技术(ELISA)检测CD40L诱导OF合成ICAM-1的蛋白水平。 3.预先添加各种信号通路抑制剂(PD98059,SB203580,SP600125,PDTC,PP1)后,应用实时荧光定量PCR检测CD40L诱导OF合成ICAM-1的mRNA水平;应用Western-blot方法检测CD40L刺激OF引起MAPKs家族(p38、ERK1/2、JNK)的磷酸化改变;应用EMSA方法检测CD40L刺激OF引起NF-κB的活性改变。 4.应用Western-blot方法检测CD40L刺激OF引起Src家族(Syk、Lyn)的磷酸化改变;预先调加Syk激酶抑制剂(Piceatannol)后,应用实时荧光定量PCR检测CD40L诱导OF合成ICAM-1的mRNA水平;应用Western-blot、EMSA方法检测Syk激酶与MAPKs、NF-κB信号通路之间的关系。
5.构建pEGFP-C2-TSHR质粒,肌肉注射免疫6周龄雌性BALB/c小鼠(实验组15只、对照组10只),第3和6周加强免疫两次。第18周时分别处死两组小鼠,分离其甲状腺和眼眶组织行普通光学显微镜检查;摘眼球取血,以放射免疫法测定小鼠血清TT4水平,ELISA法检测血清TRAb。 因为 结果 1.免疫组化结果显示:GO组的眼眶结缔组织中可见高表达CD40、ICAM-1蛋白的成纤维细胞以及高表达ICAM-1的血管内皮细胞,可见散在分布的CD4+、CD8+淋巴细胞,大量淋巴细胞高表达LFA-1;双酶标组化显示CD40阳性表达的成纤维周围浸润CD40L阳性表达的淋巴细胞;ICAM-1强阳性的眼眶成纤维细胞与LFA-1强阳性淋巴细胞以直接接触的形式存在;在ICAM-1阳性的血管内皮细胞旁聚集大量LFA-1阳性的淋巴细胞。成功培养原代眼眶成纤维细胞。 2. RT-PCR及ELISA结果显示GO组的眼眶成纤维细胞在静息状态时,ICAM-1的mRNA水平和蛋白水平都高于正常组(P<0.05);两组的OF经CD40L诱导后ICAM-1的mRNA水平和蛋白水平都高于静息状态(P<0.01),在CD40L激活后2小时,mRNA水平达到最高值(P0.05)。 4.Western-blot结果显示CD40L激活眼眶成纤维细胞后,Src家族的两种激酶(Syk、Lyn)都发生了不同程度的磷酸化改变,Lyn的磷酸化时相要早于Syk。荧光定量PCR结果显示:Syk激酶抑制剂(Piceatannol,10μM)明显减少ICAM-1的mRNA相对表达量(P<0.05)。EMSA及Western-blot结果显示Syk激酶抑制剂(Piceatannol,10、25μM)显著性降低NF-κB的活性和IκB的磷酸化水平(P
Visfatin/Nampt是一个比较复杂的蛋白。它既被发现是哺乳动物NAD合成的限速酶,又被发现是一种主要由内脏脂肪分泌的脂肪细胞因子,具有广泛的生物学功能。首先,它控制着NAD的合成,极大地调控了生物体的各种生物学功能。另外,它还能促进细胞增殖、参与炎性应答、调节细胞分化、抗细胞凋亡、参与细胞周期,调控胰岛素分泌等等。临床研究发现,Nampt/visfatin/PBEF与多种临床疾病密切相关,如1型糖尿病、2型糖尿病、急性肺部炎症和败血症、类风湿性关节炎、肥胖和脂代谢异常、胰岛素抵抗和代谢综合征、妊娠和分娩、妊娠期糖尿病、肾病、铁代谢异常等等。在各种文章中,visfatin/
selleck化学 Nampt/PBEF这三个名字均有应用,造成了一定的混乱。Visfatin最为常用,而Nampt被HUGO基因命名法委员会和小鼠基因命名法委员会共同确认为官方命名。因此,在本文中,将一直使用visfatin/Nampt。 Visfatin/Nampt的在各种组织内均有表达,这种广泛表达性预示着其多功能性。国际上对于visfatin/Nampt在心血管系统中的作用,比如对内皮细胞的增殖,在动脉粥样硬化斑块中的作用等已经有一些报道[1-3]。但是,并没有任何关于visfatin/Nampt的直接对于血管活性是否有调节作用的报道。本课题针对visfatin/Nampt在心血管系统的作用,尤其是血管外膜脂肪和血管中层平滑肌的旁分泌作用、visfatin/Nampt在8种心血管病理动物模型上的表达变化以及visfatin/Nampt对缺血性脑卒中的保护作用,进行了详细的研究。并在此基础上,着重探讨了visfatin/Nampt促VSMC增殖和visfatin/Nampt的神经保护作用的机制。最后提出了visfatin/Nampt在PVAT和血管中层VSMC间的旁分泌作用机制和visfatin/Nampt通过LKB1-AMPK-mTOR通路发挥神经保护作用的机制。
点击此处 具体实验如下: 第一部分:在第一部分的工作中,我们主要对visfatin/Nampt在心血管系统的生理活性和功能进行探讨。我们的实验结果显示:visfatin/Nampt本身并没有血管收缩或舒张作用,不参与对血管的张力调节。血管外膜脂肪(PVAT)高表达并且可以分泌visfatin/Nampt,而PVAT分泌出来的visfatin/Nampt可以通过旁分泌作用于与血管外膜脂肪邻近的血管中膜平滑肌细胞层,并通过NMN依赖的、ERK1/2和p38介导的机制促进VSMC的增殖过程。此现象的阐明对血管生物学以及动脉粥样硬化的发生发展,肥胖、糖尿病的发病机制研究及治疗都具有一定的作用。 实验一:利用Real-Time PCR和Western blotting技术,我们在mRNA和蛋白两个水平证实visfatin/Nampt在PVAT上高表达,而且表达量比内脏脂肪还要高。另外,和大鼠类似,visfatin/Nampt在猴的PVAT上高表达,超过内脏脂肪表达量。而在浓缩的PVAT孵育液中,我们探测到了visfatin/Nampt,浓度和血清visfatin/Nampt相当。这说明血管外膜脂肪是高表达并且可以分泌visfatin/Nampt的。 实验二:Vsfatin/Nampt不影响血管收缩和舒张功能,也不影响PVAT的抗血管收缩功能。直接加入累积剂量(0.