AGE-LDL对人肾小管上皮细胞MAPK的影响
1. AGE-LDL对人肾小管上皮细胞MAPK表达的影响 人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)分别加入100μg/ml AGE-LDL和10μg/ml LPS于0、5min、15min、30min及1小时收集细胞。Western-blot检测MAPK激酶(p38、JNK、ERK)和磷酸化MAPK激酶(p-p38、p-JNK、p-ERK)的蛋白表达情况。 2.抑制MAPK后,AGE-LDL诱导人肾小管上皮细胞IL-6 mRNA的变化 人小管细胞上皮(HK-2细胞)DMSO、PD98059、SB203580 (p38)、SP420119 (JNK). UO126(ERK)各10μmol/ml预孵2小时后,用AGE-LDL(100μg/ml)刺激6小时,收集细胞,提取总RNA,行RT-PCR检测IL-6 mRNA。 3.阻断TLR4后,AGE-LDL对人肾小管上皮细胞MAPK表达的影响 肾小管细胞上皮(HK-2细胞)使用TLR4 siRNA 100pmol有效干扰后或者是20μmol/L鼠抗人TLR4抗体预孵2小时后,分别加入100μg/ml AGE-LDL刺激15min后收集细胞。Western-blot检测MAPK激酶(p38、JNK、ERK)和磷酸化MAPK激酶(p-p38、p-JNK、p-ERK)的蛋白表达情况。 九.AGE-LDL对人肾小管上皮细胞NF-KB的影响 1. AGE-LDL对人肾小管上皮细胞NF-KB/p65表达的影响 也许 人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)分别加入100μg/ml AGE-LDL和10μtg/ml LPS于0、5min、15min、30min、1h、3h及6小时收集细胞。Western-blot检测NF-κB/p65和磷酸化NF-κB(p-p65)的蛋白表达情况。 2. AGE-LDL对人肾小管上皮细胞NF-KB/p65的核转移 人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)培养于置有盖玻片的6孔细胞培养板上分别加入100μg/ml AGE-LDL或10μg/ml LPS刺激0、15min和30min。固定,封闭后,加入抗人NF-κB/p65抗体一抗过夜,用非免疫兔IgG作阴性对照,Alex488荧光标记的羊抗兔二抗避光孵育45分钟,Hochest
33258染核,树脂封片。在共聚焦显微镜下观察、拍片。 3.阻断TLR4后,AGE-LDL对人肾小管上皮细胞NF-κB表达的影响 肾小管细胞上皮(HK-2细胞)使用TLR4 siRNA 100pmol有效干扰后或者是20μtmol/L鼠抗人TLR4抗体预孵2小时后,分别加入100μg/ml AGE-LDL刺激15min后收集细胞。Western-blot检测NF-κB/p65和磷酸化NF-κB(p-p65)的蛋白表达情况。 4. Myd88/TRIF siRNA干扰后,AGE-LDL对小管上皮细胞NF-KB表达的影响 肾小管细胞上皮(HK-2细胞)使用Myd88/TRIF siRNA 100pmol有效干扰后,分别加入100μg/ml 这个 AGE-LDL或10μg/ml LPS刺激15min后收集细胞。Western-blot检测NF-KB/p65和磷酸化NF-κB(p-p65)的蛋白表达情况。 5.阻断NF-κB干扰后,AGE-LDL诱导人肾小管上皮细胞IL-6 mRNA的变化肾小管细胞上皮(HK-2细胞)使用NF-KB/p65 siRNA 100pmol有效干扰后或者是10(imol/L NF-κB/p65抑制剂Bay11-7082预孵2小时后,分别加入100μtg/mlAGE-LDL刺激6h后收集细胞,提取总RNA,行RT-PCR检测IL-6 mRNA。 十.CD36参与AGE-LDL诱导人肾小管上皮细胞表达IL-6 肾小管细胞上皮(HK-2细胞)使用CD36 siRNA 100pmol有效干扰后,或者是20μmol/L鼠抗人CD36抗体预孵2小时后,分别加入100μg/ml AGE-LDL刺激6小时后收集细胞,提取总RNA,行RT-PCR检测。
十一.统计学方法 所有数据均代表3次重复实验的结果,以X±S表示。多个样本均数的比较采用One-Way ANOVA,两两比较采用LSD和SNK。实验中不同时间点之间的同一变量比较采用独立样本t检验。所有统计由统计软件SPSS13.0完成,P0.05)。 3.3 TLR4中和抗体抑制(?)AGE-LDL促进的HK-2细胞产生IL-6 mRNA 使用鼠抗人TLR4中和抗体,可以抑制(?)AGE-LDL促进的HK-2细胞产生IL-6mRNA (F= 142.096, P=0.000)。结果示10μg/ml和20μg/ml抗体预孵细胞后,可以有效的降低AGE-LDL诱导HK-2产生IL-6 mRNA水平。 3.4阻断或中和TLR4受体,可以减少AGE-LDL促进的HK-2细胞分泌IL-6 使用鼠抗人TLR4中和抗体或siRNA干扰TLR4表达,可以抑制AGE-LDL促进的HK-2细胞产生IL-6蛋白分泌(F=165.849,P=0.000) 此网站 3.5 AGE-LDL对人肾小管上皮细胞TLR4表达的影响 本实验结果显示,AGE-LDL 100μg/ml对人肾小管上皮细胞的TLR4蛋白表达上没有影响(F=0.543,P=0.740) 四.Myd88/TRIF在AGE-LDL刺激HK-2细胞产生IL-6中的作用 4.1 AGE-LDL对HK-2细胞Myd88和TRIF表达的影响 本实验结果显示,AGE-LDL 100μg/ml对人肾小管上皮细胞的Myd88和TRIF蛋白表达没有影响(F=0.122,P=0.992) 4.2 Myd88和TRIF SiRNA分别抑制HK-2细胞表达Myd88和TRIF 使用上海吉泰生物科技公司的合成的人Myd88和TRIF siRNA,可以有效抑制HK-2细胞表达Myd88和TRIF SiRNA蛋白。 4.3 Myd88和TRIF SiRNA干扰后抑制(?)AGE-LDL促进的HK-2细胞产生IL-6 Myd88 siRNA干扰HK-2细胞后,可以有效的降低AGE-LDL和LPS诱导的HK-2所产生的IL-6 mRNA水平升高(F=l 10.374, P=0.000); TRIF siRNA干扰HK-2细胞后,对于AGE-LDL诱导的HK-2说产生IL-6 mRNA的没有明显的影响(P>0.05),而可以有效的降低LPS诱导的HK-2所产生的IL-6 mRNA水平升高(P0.05) 5.3阻断TLR4受体后,对AGE-LDL引起的HK-2细胞MAPK亚基磷酸化的影响 使用鼠抗人TLR4中和抗体或siRNA干扰TLR4表达后,可以降低AGE-LDL1001μg/ml在15min引起的HK-2细胞p38/MAPK(F=218.083,P=0.000)和JNK/MAPK磷酸化(F=67.954,P=0.000) 六.